3種植物浸提液對土人參愈傷組織多糖和黃酮含量的影響

陳志寬　張楊　賴育菠　劉順會　陸幸妍

摘要[目的]探討胡蘿卜、土豆、番茄的浸提液對土人參愈傷組織的多糖和黃酮含量影響。[方法]在土人參愈傷組織誘導培養基中分別添加胡蘿卜、土豆、番茄浸提液誘導愈傷組織生成，培養25 d后，用紫外分光光度計法測定土人參愈傷組織多糖和黃酮的含量。[結果]3種浸提液都能提高土人參愈傷組織多糖含量（P<0.01）；其中以添加胡蘿卜浸提液的最高，但胡蘿卜浸提液對土人參愈傷組織的黃酮含量沒有顯著影響（P>0.05）；土豆浸提液和番茄浸提液則使土人參愈傷組織黃酮含量降低（P<0.05）。[結論]培養基中添加胡蘿卜、土豆和番茄浸提液有助提高土人參愈傷組織的多糖含量，但未能提高甚至會降低其黃酮含量。

關鍵詞土人參[Talinum paniculatum （Jacq.）Gaertn]；愈傷組織；植物浸提液；多糖；黃酮

中圖分類號S567文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）07-01910-03

基金項目廣東藥學院2012年省級大學生創新創業訓練計劃項目（1057312001）；廣東藥學院2012年校級大學生創新實驗項目（14）。

作者簡介陳志寬（1990-），男，廣東廉江人，本科，專業：生物技術。*通訊作者，劉順會，副教授，從事生態學研究。*通訊作者，陸幸妍，副教授，從事細胞生物學研究。

收稿日期20140210土人參[Talinum paniculatum （Jacq.）Gaertn]，又名人參菜，屬馬齒莧科1年生或多年生草本植物[1]，主要分布于安徽、河南、廣西、廣東、四川、貴州和云南等地。土人參含環烯醚萜、蒽醌類、多糖、黃酮類和揮發油等化合物[2]，主要用于治療氣虛乏力、肺癆咳血、眩暈和月經不調等[3]。隨著土人參食療功效研究的深入開展，作為一種集食用、藥用、觀賞為一體的新型保健食材，其潛在價值正日益顯現。

植物多糖是單糖通過糖苷鍵連接而成的聚合物，是一類重要的信息分子。研究發現，多糖及糖復合物參與和介導了細胞各種生命現象的調節，具有免疫調節、降血糖血脂和抗凝血等生物活性[4]。冉靚等還發現，土人參多糖對PC12細胞的生長有一定促分化作用[5]。黃酮類化合物是具有多種的生物學活性的次生代謝產物。研究表明，土人參黃酮具有清除羥自由基、超氧離子自由基的作用，其抗氧化性明顯[6]。

自20世紀90年代對土人參的研究開展以來，對土人參化學成分的研究大多從檢測和藥理兩個層面深入，而設計試驗影響土人參化學成分含量的研究并不多見。試驗在借鑒自然界不同植物品種之間存在相生相克特性的背景之下，探討胡蘿卜、土豆、番茄3種浸提液的添加培養對土人參愈傷組織中多糖和黃酮含量的影響，以期為進一步探究植物組織培養過程中不同植物品種材料之間相互作用的機制提供試驗數據，并為土人參這一新型保健食材的開發利用提供借鑒。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象。土人參植株，由廣東藥學院生命科學與生物制藥學院劉順會副教授饋贈，取其新鮮、嫩綠葉片作為組培材料。

1.1.2主要儀器。SB5200D超聲波清洗機，購自寧波新芝生物有限公司；TGL16G離心機，購自上海安亭科學儀器廠；759紫外可見分光光度計，購自上海菁華科技儀器有限公司；TE212L電子天平，購自SARTORIUS CO.GERMANY。

1.1.3主要試劑。濃硫酸，購自衡陽市凱信化有限公司；蒽酮，購自Aladdin industrial corporation；蘆丁，購自Aladdin chemistry co.Ltd；無水葡萄糖、硝酸鋁、亞硝酸鈉、無水乙醇均為分析純，購自廣州化學試劑廠。

1.2方法

1.2.1材料的預處理。取新鮮外植體，消毒后切成 0.1 cm3大小接種到基礎培養基上，暗培養10 d。基礎培養基為：MS+2.0 mg/L 6BA+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖。

1.2.2植物浸提液的制備。分別稱取削皮后的胡蘿卜、土豆和番茄各100.00 g，切碎后放入攪拌機中，統一加入50 ml單蒸水，攪拌至成勻漿狀態。取出所有勻漿過8層紗布，丟棄殘渣，濾液用12 000 r/min離心，取上清液備用。在無菌操作條件下，吸取上清液透過0.22 μm濾膜，將濾液收集在已高壓滅菌的15 ml離心管中。

1.2.3含植物浸提液培養基的制備。對基礎培養基進行高壓滅菌，待其無菌培養基冷卻15 min后，吸取2 ml無菌浸提液加入到23 ml基礎培養基中，用槍反復吹打并搖勻，待其完全冷卻凝固備用。

1.2.4愈傷組織培養。將土人參愈傷組織轉移至含植物浸提液的培養基中，在光照度2 000 lx、12 h/d條件下培養25 d，每天觀察愈傷組織狀態。

1.2.5對照品溶液和供試樣品液的制備。（1）測黃酮含量的樣品制備。稱取干燥愈傷組織粉末0.400 g，按照乙醇濃度80%，料液比1∶40（g/ml，W/V，下同），浸提溫度60 ℃，浸提時間1 h，離心得上清液，定容至25 ml備用。（2）測多糖的樣品制備。稱取干燥愈傷組織粉末0.200 g，置于100 ml錐形瓶中，加沸水25 ml，加蓋，超聲提取10 min，冷卻后抽濾，殘渣用沸蒸餾水反復洗滌并抽濾，濾液收集在50 ml容量瓶中，定容至刻度，得可溶性糖的提取液。吸取提取液2 ml，置于另一50 ml容量瓶中，以蒸餾水定容，搖勻備用。

1.2.6測定波長的選擇。（1）精密量取葡萄糖標準液1.0 ml，置20 ml試管中，加入蒽酮溶液2.0 ml，參照紫外-可見分光光度法（2010版藥典附錄VA）測定，觀察紫外吸收光譜，確定最佳測定波長。（2）精密量取蘆丁標準液1.0 ml于50 ml容量瓶，加濃度5%的NaNO2 1.5 ml搖勻，放置6 min后；加濃度10%的Al（NO3）3 1.5 ml，搖勻，放置6 min；再加20 ml濃度4%的NaOH溶液，搖勻顯色，用濃度80%乙醇定容，搖勻靜置10 min，觀察紫外吸收光譜，確定最佳測定波長。

1.2.7線性關系的考察。（1）葡萄糖線性關系的考察。精密吸取0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 ml葡萄糖標準液，按“1.2.6”項下蒽酮比色法顯色，以蒸餾水為空白對照，于波長626 nm處測定吸光度。以吸光度A為縱坐標，濃度C（μg/ml）為橫坐標，繪制標準曲線，計算線性回歸方程。（2）蘆丁線性關系的考察。精密吸取0.3、0.6、0.9和1.2 ml蘆丁標準液，按“1.2.6”項下硝酸鋁絡合顯色法，以濃度80%乙醇為空白對照，于波長254 nm處測定吸光度。以吸光度A為縱坐標，濃度C（mg /ml）為橫坐標，繪制標準曲線，計算線性回歸方程。

1.2.8精密測定與計算。按上述方法測定各組的多糖和黃酮吸光度值，經標準回歸方程計算得出提取液中多糖或黃酮濃度，根據下列公式求出各組多糖和黃酮的百分含量。

多糖/黃酮的含量=CV總D1mV測×100%

式中：C（mg/ml）：由回歸方程得出的多糖或黃酮濃度；V總（ml）為土人參多糖和黃酮提取液的總體積；V測（ml）為測定時取用樣品的體積；D為稀釋倍數；m（mg）為樣品質量。

1.2.9統計學處理。采用SPSS 13.0進行數據處理，組間多重比較采用單向方差分析（OneWay ANOVA）。P<0.05為差異有顯著性，P<0.01為差異有極顯著性。

2結果與分析

2.1測定波長的選擇葡萄糖溶液的紫外吸收光譜顯示，λmax=626 nm，故選擇626 nm為多糖測定波長。蘆丁標準液的紫外吸收光譜顯示，λmax=254 nm，故選擇254 nm為黃酮測定波長。

2.2線性關系的考察計算得葡萄糖標準液的線性回歸方程為：Y=0.011 3X-0.020 2，相關系數R為0.998 8。試驗結果表明，在0.200～1.200 mg/ml范圍內，葡萄糖濃度與吸光度呈良好的線性關系。計算得蘆丁標準液的線性回歸方程為：Y=248.600 0X+0.063 1，相關系數R為0.990 7。試驗結果表明，在0.400～1.800 mg/ml范圍內，蘆丁濃度與吸光度呈良好的線性關系。

2.3含植物浸提液培養基對土人參多糖含量的影響圖1表明，與對照組相比，胡蘿卜組和土豆組的多糖含量均顯著提高（P<0.01），其中胡蘿卜組的多糖含量高于對照組的7.5%，增長89.1%；土豆組的高于對照組的5.6%，增長66.7%；番茄組的沒有顯著性差異（P>0.05）。與番茄組相比，胡蘿卜組和土豆組的多糖含量亦是極顯著高于番茄組（P<0.01），分別相差6.7%和4.8%；與土豆組相比，胡蘿卜組無顯著性差異（P>0.05）。

注：與對照組比較**P<0.01；與番茄組比較##P<0.01。

圖1不同植物浸提液添加培養對土人參愈傷組織多糖含量的影響（n=3）2.4含植物浸提液培養基對黃酮含量的影響圖2表明，相比對照組的黃酮含量，土豆組和番茄組的黃酮含量顯著低于對照組（P<0.05），分別降低0.3%和0.5%；而胡蘿卜組的黃酮含量與對照組的黃酮含量僅相差0.1%，無顯著性差異（P>0.05）。與胡蘿卜組比較，土豆組和番茄組的黃酮含量顯著低于胡蘿卜組的黃酮含量（P<0.05），分別相差0.4%和0.6%；而番茄組和土豆組的黃酮含量相比則無顯著性差異（P>0.05）。