鶯歌海鹽場30%鹽度曬鹽池底泥中可培養芽胞桿菌資源遺傳多樣性研究

周秋平等

摘 要 采用80 ℃水浴處理與稀釋涂布法從鶯歌海鹽場30%鹽度曬鹽池底泥中分離獲得215株芽胞桿菌。采用16S rDNA PCR-RFLP與16S rDNA序列分析技術，對分離的菌株進行遺傳多樣性分析。16S rDNA PCR-RFLP酶切圖譜UPGMA聚類分析結果表明，在100%的相似性水平上，分離菌株歸屬到9種酶切類型。16S rDNA測序結果顯示，這些菌株主要分布在Pontibacillus、Halobacillus、Oceanobacillus和Bacillus等4個屬，其中Pontibacillus為優勢屬。有7株芽胞桿菌的16S rDNA序列與數據庫中相應模式菌的最大相似性在97.4%～99.0%之間，有可能為芽胞桿菌新種資源。

關鍵詞 芽胞桿菌；多樣性；16S rDNA PCR-RFLP；系統發育分析

中圖分類號 S476.1 文獻標識碼 A

Abstract 215 Bacillus-like bacterial strains were obtained from Yinggehai Saltern sediment of 30% salinity salt pond by using the method of 80 ℃ water bath treatment and diluting spread. The genetic diversities were analyzed by 16S rDNA PCR-RFLP and 16S rRNA gene sequence analysis. In the similarity level of 100%， cluster analysis of UPGMA map and 16S rDNA PCR-RFLP macrorestriction map showed that the isolates were grouped into 9 clusters， including genus Pontibacillus， Halobacillus， Oceanobacillus and Bacillus， in which Pontibacillus was the dominant one. Based on the comparison of 16S rRNA gene sequences， the highest similarities of seven strains with the corresponding type strains ranged from 97.4% to 99.0%. The results showed that culturable Bacillus-like species from Yinggehai Saltern sediment revealed high genetic diversity and there existed some novel species.

Key words Bacillus-like species； Diversity； 16S rDNA PCR-RFLP； Phylogeny analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.028

芽胞桿菌為土壤細菌中的常見類群，是一類好氧或兼性厭氧、革蘭氏染色多為陽性、能產生芽胞的化能異養型細菌，廣泛分布于各種生態環境中，如水體[1]、土壤[2]、深海沉積物[3]。芽胞桿菌種類繁多、數量巨大、能夠產生多種生理活性物質和代謝產物。芽胞桿菌在工農業、醫藥衛生、環保等領域具有廣泛的用途，如防治植物病蟲害[4]、處理工業廢水[5]等。

鶯歌海鹽場位于海南省樂東縣西南部海濱，是中國南方最大的海鹽廠，海灘涂地帶鹽田總面積37.97 km2，占全島鹽田總面積的63%，屬人工形成的海洋高鹽環境。高鹽環境中存在著獨特的微生物區系，過去對陸地高鹽環境中微生物的研究較多[6-11]，且發現芽胞桿菌屬為優勢菌群。鶯歌海鹽場由一系列的曬鹽池組成，本研究對鶯歌海鹽場鹵水鹽度為30%曬鹽池底泥中的可培養芽胞桿菌資源進行分離培養及遺傳多樣性研究，為了解、利用極端環境中的芽孢桿菌資源奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 底泥樣品采集于鶯歌海鹽場鹵水鹽度為30%的曬鹽池。采用5點采樣法采集5～25 cm深的底泥50 g左右，放入無菌采樣袋中混合均勻，冰盒儲存，及時帶回實驗室進行菌株分離，剩余樣品置4 ℃冰箱中保存備用。

1.1.2 培養基 R2A培養基：1 000 mL中含有可溶性淀粉10 g，酵母膏0.5 g，蛋白胨0.5 g，酸水解酪素0.5 g，葡萄糖 0.5 g，丙酮酸鈉0.3 g。PBMY培養基：1 000 mL中含有蛋白胨10 g，酵母膏3 g，牛肉膏0.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g。改良營養瓊脂培養基：1 000 mL中含有牛肉膏0.3 g，蛋白胨1 g。淡薄培養基：1 000 mL中含有酵母膏0.7 g，蛋白胨1 g，葡萄糖1 g，（NH4）2SO4 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO4 1 g。所有培養基鹽濃度15%，采用30%的鹵水稀釋配制，pH7.0，瓊脂粉20～25 g/L。

1.2 方法

1.2.1 芽胞桿菌的分離純化 稱取10 g底泥樣品，放入盛有90 mL無菌鹵水的三角瓶中，置恒溫搖床中振蕩30 min（30 ℃、200 r/min）；將得到的懸液稀釋至10-1～10-6梯度，80 ℃水浴處理20 min以滅活非芽胞細菌；吸取熱處理后的懸液0.1 mL，涂布平板，于30 ℃培養箱中倒置培養，觀察菌落形狀、顏色等表型特征，挑單菌落劃線純化，直至得到純培養。

1.2.2 芽胞桿菌16S rDNA PCR-RFLP多樣性分析

基因組DNA的提取參照相關文獻[12]進行。選用以下引物（由上海生工生物技術有限公司合成）擴增16S rDNA基因：P1（5′-AGAGTTTGATCCTGGCT

CAGAACGAACGCT-3′），P6（5′-TACGGCTACCTTG

TTACGACTTCACCCC-3′）。PCR反應程序為： 95 ℃ 15 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，共30個循環；72 ℃ 10 min。擴增產物經MspⅠ（TaKaRa）酶切后，用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測。用NTSYS-pc2.01軟件進行相似性分析，采用平均連鎖法（UPGMA）聚類，得出菌株間的聚類關系[13]。

1.2.3 16S rDNA序列測定及其系統發育分析

從16S rDNA PCR-RFLP分型的不同遺傳類型中，各選取1～2株菌進行16S rDNA測序（由上海生工生物工程有限公司完成）。將測序結果在EzTaxon server 2.1和GenBank 中進行BLAST比較分析。采用MEGA5.0以鄰位相連法（Neighbor-Joining）構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 芽胞桿菌的分離

采用80 ℃水浴處理與稀釋涂布相結合的方法，從4種培養基上共分離獲得芽胞桿菌215株。分離于R2A培養基的72株，占分離總數的33.5%；分離于PBMY培養基的61株，占28.4%；分離于改良營養瓊脂培養基的48株，占22.3%；分離于淡薄培養基的34株，占15.8%。在R2A培養基上生長的菌落，形態種類較多，而淡薄培養基上的菌落形態較少。

2.2 鶯歌海鹽場曬鹽池底泥芽胞桿菌遺傳多樣性

從鶯歌海鹽場30%鹽度曬鹽池底泥中分離的215株芽胞桿菌，經16S rDNA PCR-RFLP初步分型，每1個限制性片斷長度多態性類型代表1種酶切類型，共得到9種酶切類型，從9種類型中選出18株代表菌株的酶切圖譜見圖1。由代表菌株的聚類樹狀圖（圖2）可知，相似系數為0.62時，芽胞桿菌分為2個類群；相似系數為0.81時，分為7個類群；相似系數增大至1.00時，芽胞桿菌可分為9個類群。

2.3 菌株16S rDNA序列測定及其系統發育分析

根據每個遺傳型包含的菌株數量及其菌落形態特征，從9種酶切類型中選取15株代表菌進行16S rRNA基因序列的測定。將所得序列在EzTaxon server 2.1和GenBank中進行Blast比對分析。結果顯示，鶯歌海鹽場曬鹽池底泥可培養芽胞桿菌資源主要分布在芽胞桿菌科（Bacillaceae）和類芽胞桿菌科（Paenibacillaceae）。其中，Bacillaceae科下包含喜鹽芽胞桿菌屬（Halobacillus，33.3%）、芽胞桿菌屬（Bacillus，占13.3%）、海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus，6.7%）3個屬；Paenibacillaceae科下有Pontibacillus屬（占46.7%），為可培養芽孢桿菌的優勢屬，Halobacillus為次優勢屬。

通過序列比對還發現，16S rDNA最大同源性在99.3%以上的有8株；同源性在98%～99%的有4株，分別是HB12542（98.0%）、HB12541（98.0%）、HB12547（98.1%）和HB12543（98.9%）；同源性在98%以下的有3株，分別是HB12536（97.7%）、HB12548（97.4%）和HB12569（97.8%）。這6株菌有可能代表著芽胞桿菌的新資源，為潛在的新分類單元。

各菌株間的系統進化關系見圖3所示。菌株HB12527與菌株HB12530屬于Pontibacillus屬，在系統發育樹上聚為一簇，親緣關系較近；菌株HB12535與Pontibacillus yanchengensis聚于一簇，參考其16S rDNA的最大同源性數值（99.7%），推測HB12535可能為Pontibacillus yanchengensis；而HB12536、HB12542、HB12547和HB12569聚于系統發育樹上Pontibacillus屬的另一簇，同時其16S rDNA最大同源性為97.7%～98.1%，這4株菌可能代表著Pontibacillus屬新的分類單元。菌株HB12541與Halobacillus naozhouensis的序列相似性最高（98.0%），但在系統發育樹中處于一個相對獨立的分支，也可能是潛在的新種，有待于進一步進行多相分類以確定其最終歸屬地位。

3 討論與結論

高鹽環境微生物具有獨特的種群類型，它們具有特殊的生理機制及代謝產物類型，是一類極具開發潛力的生物資源。本文對鶯歌海鹽場30%鹽度曬鹽池底泥中可培養芽胞桿菌資源進行研究，從中分離到215株芽胞桿菌，序列分析結果表明，這些菌株分屬于Pontibacillus、Halobacillus、Oceanobacillus和Bacillus屬，存在較高的多樣性；此外，系統發育分析表明，鶯歌海高鹽環境不同種芽胞桿菌間的進化距離比較接近。

海洋（或沿海）高鹽環境中的微生物區系不同于內陸高鹽環境[14]。肖煒[6]在研究昆明鹽礦古老巖鹽沉積中可培養細菌多樣性時發現，Bacillus為鹵水和鹽晶中的優勢菌，各占總細菌分離量的26.1%和59.9%。馮二梅等[15]對煙臺海域中度嗜鹽菌進行了分離鑒定，結果表明這些菌分布于7個屬，其中芽胞桿菌有Bacillus、Virgibacillus、Gracilibacillus。在陸地高鹽環境的研究中，鄭賀云等[7]在研究新疆阿克蘇地區鹽堿地中細菌多樣性時得出，Bacillus為其中的主要類群。潘媛媛等[8]在松嫩平原鹽堿地中也發現了Bacillus和Oceanobacillus資源。對新疆不同地區高鹽環境中嗜鹽菌的研究結果表明，不同高鹽地區的嗜鹽菌在組成上具有一定的相似性：Bacillus和Halobacillus在這些地區均有分布，但在各地區的優勢度不同[9-11]。本研究在鶯歌海30%鹽度曬鹽池底泥中也發現了Halobacillus、Oceanobacillus和Bacillus等嗜鹽芽胞桿菌資源，反映出不同高鹽環境芽胞桿菌資源在群落組成上具有一定的相似性。但是，本研究中Pontibacillus為優勢屬，與陸地高鹽環境中的不同，這也證明了海洋高鹽環境中芽胞桿菌資源的獨特性。

本研究還發現了一些潛在的芽孢桿菌新種，鶯歌海高鹽環境曬鹽池底泥中分離的嗜鹽菌HB12536與模式菌種Pontibacillus yanchengensis的親緣關系最近（相似性為97.7%），是Pontibacillus屬的潛在新種。Pontibacillus yanchengensis是一株革蘭氏陽性、嚴格好氧的中度嗜鹽芽胞桿菌[16]。菌株HB12541與模式菌種Halobacillus naozhouensis的親緣關系最近（相似性為98.0%），而Halobacillus naozhouensis是一株革蘭氏陽性、具有過氧化氫酶活性、好氧的桿狀中度嗜鹽細菌[17]。中度嗜鹽細菌對環境的適應能力極強，分布廣泛，能分泌耐高溫的胞外酶（淀粉酶、脂肪酶等）和多聚體，可應用于食品工業、酶制劑和化妝品生產、石油回收、基因工程領域以及環境污染的生物修復領域有著廣泛的應用前景[18]。由此可見，鶯歌海高鹽環境曬鹽池底泥中存在著較為豐富的芽孢桿菌資源，并且存在一些潛在的芽孢桿菌新種，有待進一步研究開發。

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