巴西橡膠樹棒孢霉落葉病菌毒素基因cc004—cas克隆及致病作用

劉曉妹等

摘 要 為了探明多主棒孢菌（Corynespora cassiicola）毒素基因cc004-cas序列特征及其功能，以巴西橡膠樹棒孢霉落葉病菌為材料，采用SEFA-PCR和RT-PCR技術對毒素基因cc004-cas進行擴增，并通過插入潮霉素B基因獲得其突變體。序列特征分析結果表明，cc004-cas基因DNA和cDNA全長分別為2 800 bp和180 bp，編碼區含2個內含子（67 bp和49 bp），推測編碼59個氨基酸，其分子量約為5.92 ku，等電點pⅠ為5.70，與NCBI中報道的C. cassiicola毒素基因cas編碼的毒素前體pro-cassiicolin的氨基酸序列（0HABV25895.1）相似性達85%。cc004-cas突變體表型測定結果表明：在菌落和菌絲形態、生長，產孢量、孢子萌發，菌絲生長對溫度、pH要求，產生漆酶和纖維素酶的能力方面與野生型無顯著差異；但用菌餅接種橡膠樹嫩葉，致病力略有下降，用粗毒素接種時，致病力明顯減輕，可見毒素是多主棒孢菌的一個重要的毒力因子，但不是唯一的因子。

關鍵詞 多主棒孢菌；毒素基因；克?。恢虏×?/p>

中圖分類號 S794.1 文獻標識碼 A

Abstract To reveal the sequence features and the function of a toxin encoding gene cc004-cas，cc004-cas gene was cloned from Corynespora cassiicola on Hevea brasiliensis by the method of SEFA-PCR and RT-PCR，and its knockout mutant was gained by inserting hygB gene into cc004-cas gene. Analysis of sequence characterization showed that the complete DNA and cDNA sequence of cc004-cas gene was 2 800 bp and 180 bp in size， respectively， with two introns of 67 bp and 49 bp， respectively， encoding a putative protein of 59-amino acid with a molecular weight of 5.92 ku and isoelectric point of 5.70. Analysis indicated that the putative protein of cc004-cas gene was homologous to C. cassiicola cas toxin gene coding product-pro-cassiicolin（0HABV25895.1）with a similarity of 85% in NCBI. Phenotype changes of a cc004-cas gene mutant were tested and there were no obvious difference in the colony color， mycelia morphology and growth， sporulation quantity， conidial germination， requirement of temperature and pH， and laccase and cellulase production between the mutant and the wild type. However the young leaves of the rubber tree inoculated with mycelia plugs produced typical symptoms but demonstrated weak virulence. While crude toxin was tested for pathogenicity， it displayed weaker virulence. That indicated cc004-cas toxin was a impotant virulence factor but not a unique factor in the pathogenicity of C. cassiicola in Hevea brasiliensis.

Key words Corynespora cassiicolas；Toxin gene；Cloning；Pathogenicity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.025

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）屬大戟科三葉橡膠樹屬，是熱帶經濟作物之一，其產品天然橡膠與鋼鐵、石油、煤炭并列為四大工業原料。由多主棒孢菌[Corynespora cassiicola（B.&C.）Wei]引起的巴西橡膠樹棒孢霉落葉病是國際上公認的繼南美葉疫病之后的又一個為害巴西橡膠樹的重要病害，2006年開始在中國膠苗上發生[1]，現已開始為害成齡的開割橡膠樹[2]。早在1975年Onesirosan等[3]就發現多主棒孢菌能產生毒性物質。2000年Breton等[4]確定該毒性物質是一種蛋白物質，并定命為“Cassiicolin”。2007年De Lamotte等[5]確認Cassiicolin是一種寄主專化性毒素，凝膠電泳顯示大小約15 ku，經色譜測定，Cassiicolin是一種由27個氨基酸組成的富含半胱氨酸的糖蛋白，分子量為2 885 ku，與現有數據庫中的蛋白沒有明顯的同源序列。隨后Cassiicolin的空間結構得到了確定[6]。2009年該毒素的抗體被獲得[7]。中國也純化出了該毒素，凝膠電泳顯示大小為14.4 ku[8]。2011年Déon等[9]從分離自橡膠樹C. cassiicola的致病力強和中等的菌株中克隆到了完全相同的Cassiicolin基因cas，大小292 bp，推測由58個氨基酸組成，并提純到等量的毒素，但在弱致病力菌株中卻未克隆到該基因，也未提純到該毒素，進一步研究發現該菌株致病力的差異與該毒素性質無關，而與其轉錄水平有關，一般在接種后1～2 d轉錄水平達到高峰，Déon等[9]據此推測Cassiicolin毒素是C.cassiicola侵染寄主早期的重要致病因子。不同來源的多主棒孢菌在形態、生理特性及致病力等方面存在明顯的差異[10]?；蛟S來自國內橡膠樹C. cassiicola的毒素基因與來自國外的也存在差異，且國內外尚缺乏從分子水平上敲除該毒素基因、對其功能進行確切鑒定的數據。因此，本研究對分離自國內巴西橡膠樹C. cassiicola的毒素基因cc004-cas進行克隆和敲除鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試病菌和品種 巴西橡膠樹棒孢霉落葉病病菌多主棒孢菌[C.cassiicola（B.&C.）Wei]單孢菌株CC004[10]、巴西橡膠樹感病品種RIM600，均由中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所提供。

1.1.2 試劑 Fungal gDNA Kit為BioMiga產品；pMD18-T simple Vector、1.5 U La-Taq DNA聚合酶、2×GC BufferⅠ（Mg2+ Plus）、2.5 mmol/L dNTPs為TaKaRa產品；2×Taq-Mixture Kit、Escherichia coli DH5α、TIANgel Midi Purification Kit和TIANScript cDNA First-Stand Kit為TIANGEN產品，RNA Extraction Kit為BioTeke產品；pCT74質粒由美國Oregon大學Ciuffetti博士提供；CloneEZTM PCR Cloning Kit為Script產品；DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅰ為Roche產品；潮霉素B為Roche進口分裝，Ampicillin為Amresco進口分裝；溶壁酶購自廣東省微生物研究所；其它試劑為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 巴西橡膠樹棒孢霉落葉病菌菌絲收集與核酸提取 收集用PD液培養4～5 d的菌絲。按照BioMiga Fungal gDNA Kit提取總DNA。按照BioTeke RNA Extraction Kit提取總RNA。

1.2.2 從基因組DNA擴增cc004-cas基因片段 采用同源克隆法。參照GenBank：EF667973.1設計引物TL5 5′-CACAATGAAATATCTCCC-3′和TL6 5′-AAAGTTAACATCCCGAAC-3′。擴增體系（50 μL）：2×Taq-Mixture 25 μL，引物（10 μmol/L）各2 μL，總DNA 1 μL，加ddH2O補至50 μL。擴增條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 10 min。將獲得片段命名為cc004-cas。PCR產物的凝膠回收、連接、轉化按照TIANGEN和TaKaRa相應試劑盒操作。

1.2.3 SEFA-PCR 獲得cc004-cas基因DNA全長 參照SEFA-PCR（Self-Formed Adaptor PCR）引物設計原理[11]，根據已獲的cc004-cas基因序列設計擴增5′端和3′端的引物。5′端引物：5TL1 5′-GCCACAGAACCCGTTGCCGAAATC-3′，5TL2 5′-AAGTCAAGACGTACGCAAGACTGTCTAGG-3′，5 Hemin-TL3 5′-CAGAGATGAAGATAGG，NNN，NNN，NNN，AGATA-3′；3′端引物：3TL1 5′-GTGCGGCAG

CAGCTATTCTTCCTAGACAG-3′，3TL2 5′-CGATTT

CGGCAACGGGTTCTGTG -3′，3Hemin-TL3 5′-AAG

CTAATTTGCAT，NNN，NNN，NNN，ACAGTG-3′。

SEFA-PCR第一步擴增。擴增體系（30 μL）：2×GC BufferⅠ（Mg2+ Plus）15.0 μL， dNTPs Mix（各2.5 mmol/L）5.0 μL， Hemi-SA3（20 μmol/L）0.5μL，gDNA 1.5 μL， La-Taq酶（1.5 U）0.5 μL，補ddH2O至30 μL。擴增條件： 94 ℃ 1 min； 94 ℃ 30 s， 40 ℃ 3 min， 以每秒增加0.2 ℃的速度升至70 ℃， 70 ℃ 5 min。取出PCR管加入0.5 μL引物SA1（20 μmol/L）后繼續擴增， 擴增條件： 94 ℃ 30 s， 70 ℃ 5.5 min， 25個循環； 再進行8輪不對稱擴增（94 ℃ 30 s， 70 ℃ 5.5 min，2個循環；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，1個循環）；70 ℃ 5 min。

SEFA-PCR第二步擴增。擴增體系（30 μL）：引物SA2（20 μmol/L）0.5 μL，模板為第一步擴增產物1.5 μL，其余同第一步。擴增條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，66 ℃ 30 s（5′端）/65 ℃ 30 s（3′端），72 ℃ 5 min，33個循環；72 ℃ 10 min。

5′端和3′端第二輪擴增產物測序。由于所獲得片段太長，難于克隆測序，所以本試驗借助5′端或3′端引物TL2和Hemi-TL3之間的序列，設計了引物5TL4 5′-CTGCCGCAGCAGACGGACCCT-3′和3TL4 5′-CGACAACTGTGGTAATTCCTG-3′，分別做為5′端和3′端第二輪擴增產物的單向測序引物。

1.2.4 序列拼接與驗證 利用DNAssist1.0軟件將所得5′端和3′端序列與cc004-cas基因片段序列拼接獲得其初步的全長序列。再從兩端設計引物用高保真酶擴增、測序，驗證已獲得序列的正確性。

1.2.5 RT-PCR法擴增獲得cc004-cas基因的cDNA 用DNAssist1.0軟件對所得cc004-cas基因全長DNA與GenBank中cas基因的cDNA序列 （EF667973.1AB180104.1）比對分析后，用推定的cDNA序列設計引物對TR3 5′-TCTCCCTATCTTCA

TCTC-3′和TR4 5′-CCAGGAATTACCACAGTT-3′，按照TIANScript cDNA First-Stand Kit操作，擴增cc004-cas基因的cDNA并克隆、測序。

1.2.6 cc004-cas序列分析 利用DNAssist1.0軟件比對分析所獲得的cc004-cas基因DNA和cDNA序列，找出開放讀碼框、起始密碼子、終止密碼子、外顯子、內含子。利用BioEdit軟件分析cc004-cas基因編碼序列的化學特征。用Primer5.0軟件推測cc004-cas基因編碼的氨基酸序列。用ExPaSy軟件包中Computer PI/MW軟件分析該蛋白序列組分。

1.2.7 cc004-cas基因敲除突變體獲得及表型測定 線性化敲除載體的制備。將克隆有cc004-cas基因的pMD18-T simple Vector（命名p4CAS載體）用SalⅠ酶切，回收線性化載體p4CAS。

潮霉素B抗性基因。（hygB）的擴增與回收以pCT74質粒為模板，用引物HY3：5′-TAAAGGTA

TCATGTGAACTGGTTCCCGGTCGGC-3′和HY4：5′-AACCCGTTGCCGAAGAACTGATATTGAAGGAGCA

TTTTTT-3′（劃線部分為p4CAS載體上SalⅠ酶切位點左右序列）擴增潮酶素hygB基因片段并回收。擴增體系同1.2.2。擴增條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，35個循環；72 ℃ 10 min。

敲除載體p4CASH的生成。按照GenScript Corporation CloneEZTM PCR Cloning Kit操作，線性化p4CAS載體和hygB基因片段連接，構建敲除載體p4CASH。

cc004-cas基因敲除突變體驗證和RT-PCR分析。用敲除載體p4CASH轉化多主棒孢菌原生質體，再生培養后共獲得5個轉化子，經多次單孢純化后，先用擴增潮霉素hygB基因引物檢測。選擇編號為CTH5的突變體進行后續試驗。用XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切CTH5基因組DNA和野生菌株CC004基因組DNA進行Southern雜交驗證，酶切圖譜如圖1；雜交探針擴增引物TProbe1：5′-CATTAGCGGATGAGTTAG-3′和TProbe2：5′-GGAT

ACAGAAAGCAAGAT-3′，預期大小約878 bp，用Roche產品DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅰ標記并雜交。為了進一步驗證cc004-cas基因是否在突變體CTH5中正常轉錄，提取CTH5和CC004總RNA，以真菌18s rRNA通用引物的擴增產物作內參，以RT 1：5′-ATCTCCCTATCTTCATCT-3′ 和RT2：5′-GGAATTA

CCACAGTTGTC-3′為特異性擴增引物，參照1.2.5進行RT-PC分析。

cc004-cas基因敲除突變體表型測定。參照張賀等[12]研究方法，測定cc004-cas基因突變體CTH5在菌落和菌絲形態、生長，產孢量、孢子萌發，菌絲生長對溫度、pH要求，產漆酶和纖維素酶能力及致病力方面變化。其中致病性測定選取巴西橡膠樹感病品種RRIM600葉齡一致且完好無病斑的嫩綠色葉片，采用3種方法測定。（1）菌餅接種測定[12]：在每張嫩葉主脈每側選3個側脈輕輕刺傷，一側接種野生菌株菌餅，另一側接種突變體菌株菌餅，滴加40 μL滅菌水，28 ℃保濕培養，以接PDA瓊脂餅做空白對照。 （2）粗毒素葉片穿刺接種測定：制備野生型或突變體粗毒素[12]；每個刺傷處僅接種40 μL粗毒素，用等量Czapek培養液做空白對照，逐日觀察發病情況。 （3）粗毒素葉片萎蔫生物法測定[13]：將剪去葉柄的嫩葉稱重（鮮重），插入盛有10 mL粗毒素原液的離心管中，用等量Czapek培養液作對照，室溫培養至用野生型CC004毒素處理的葉片出現明顯萎蔫時，取出葉片擦干稱重（干重）。計算萎蔫指數[13]，確定毒素的致病力。每處理10片嫩葉。

2 結果與分析

2.1 cc004-cas基因克隆與序列分析

2.1.1 cc004-cas基因片段擴增結果 用引物TL5和TL6，以C. cassiicola總DNA為模板擴增獲得了約300 bp片段（圖2），測序后用Blastn分析，發現與cas基因（EF667973.1）的覆蓋率和相似性分別達到100%和85%，說明獲得的基因片段符合預期，定名為cc004-cas。

2.1.2 SEFA-PCR 獲得cc004-cas基因DNA全長

通過SEFA-PCR 2步成功擴增獲得cc004-cas片段上下游側翼區域（圖3）。測序表明：5′端和3′端側翼序列長分別為837 bp和1 753 bp，與已獲得cc004-cas序列拼接后，獲得大小2 800 bp序列。

2.1.3 RT-PCR法擴增獲得cc004-cas基因cDNA 經RT-PCR擴增獲得約150 bp的cDNA片段（圖4），測序表明大小為154 bp，與cas基因（EF667973.1）cDNA和cc004-cas基因的DNA序列比對拼接后獲得cDNA全長180 bp。

2.1.4 cc004-cas序列分析 cc004-cas基因全長DNA與cDNA序列分析：比對分析cc004-cas基因DNA和cDNA序列，發現起始密碼子ATG位于第802～804 bp處，終止密碼子TAA位于第1 095～1 097 bp處，自ATG到TAA的DNA序列全長296 bp，存在3個外顯子和2個內含子，外顯子大小分別為105、60、15 bp（位于第802～906，974～1 033和1 083～1 097堿基處），內含子大小分別為67和49 bp（位于第907～973和1 034～1 082堿基處），所有內含子均符合GT-AG法則。

cc004-cas基因推測蛋白的化學特征分析：用Primer5.0軟件推測cc004-cas基因編碼59個氨基酸。用ExPaSy軟件包中Computer PI/MW分析發現推測的cc004-cas毒素蛋白分子量為5.92 ku，包括2個強堿性氨基酸（KR），2個強酸性氨基酸（D），31個非極性氨基酸（AILMPWVF），24個極性氨基酸（NCQSTYHG），等電點（PI）為5.70，可見是一種酸性蛋白質，相對富含非極性氨基酸，其中丙氨酸（Ala，A）的含量最高，達18.64%；而極性氨基酸中半胱氨酸（Cys，C）、甘氨酸（Gly，G）和絲氨酸（Ser，S）的含量均為10.17%，居其次。

cc004-cas基因預測蛋白的同源性分析：利用NCBI網站中的BLASTP軟件，對該推定的氨基酸序列進行同源性比對，發現與C. cassiicola pro-cassiicolin（0HABV25895.1）的氨基酸序列相似性達85%（圖5）。因此初步確定本試驗獲得的cc004-cas基因是預期的C. cassiicola毒素基因，序列已提交GenBank（GU373809.1）。

2.2 cc004-cas基因敲除突變體的驗證與表型測定

2.2.1 cc004-cas基因敲除突變體的驗證 PCR驗證表明（圖6）：用檢測潮霉素基因的引物從6個突變體基因中均擴增出了預期大小的條帶（1 412 bp），從野生型基因組中未擴增到任何條帶，說明hygB基因已插入轉化子；Southern雜交驗證表明（圖7-A），突變體產生了1條與預期（2 118 bp）相符的雜交帶，而野生型產生了1條710 bp雜交帶，二者大小相差約1 400 bp，進一步確定hygB基因插入了毒素cc004-cas基因中，成功獲得了cc004-cas基因敲除突變體。RT-PCR分析顯示：在野生型中能擴增到了152 bp大小的特異性條帶，而在CTH5突變體中無該條帶，表明cc004-cas基因在突變體中無法正常轉錄表達（圖7-B）。

2.2.2 cc004-cas基因敲除突變體表型測定結果 與野生型相比，cc004-cas基因突變體在菌落和菌絲形態、生長，產孢量、孢子萌發，菌絲生長對溫度、pH要求，產生漆酶和纖維素酶能力沒有明顯變化。致病力測定如下：

（1）刺傷接種菌餅表明：野生型CC004與突變體CTH5的發病過程基本一致，即2 d后在接種點可觀察到明顯的壞死線，3 d后壞死線繼續擴展，且在接種點葉背出現少量灰白色菌絲體（圖8-A），4 d后壞死斑繼續擴大并出現黃色暈圈，突變體病害平均嚴重度為2.38，略低于野生型2.76。用PDA瓊脂餅接種的空白對照未表現任何癥狀。表明毒素基因突變體菌餅的致病力雖有減弱，但仍很強。

（2）粗毒素葉片穿刺接種表明（圖8-B）：取40 μL粗毒素滴于感病品種RRIM600嫩綠色葉片的刺傷處，保濕培養4 d后，用野生菌株CC004粗毒素接種的部位出現壞死斑點，壞死斑周圍的葉脈組織也呈現黑色壞死，形成了“魚骨”狀壞死線；用毒素突變體CTH5粗毒素接種的部位也有壞死斑點，但“魚骨”狀壞死線無或不清晰；用Czapek培養液接種的空白對照未表現任何癥狀；說明毒素突變體CTH5所產生的毒素對葉片的毒力作用顯著下降。

（3）粗毒素葉片萎蔫生物測定法（圖8-C）：將淡綠色葉片插入Czapek培養液，室溫下放置4 d后，少部分葉片出現輕微萎蔫和變色，大部分仍正常；但插入野生型CC004和毒素基因突變體CTH5粗毒素液中的淡綠色葉片，2 d后大多數葉片的主脈基部開始變黑，4 d后葉片明顯萎蔫，而突變體CTH5粗毒素處理的葉色失綠和萎蔫程度明顯較輕，萎蔫指數為7.60%，約為野生型CC004（32.40%）的1/4，可見毒素基因突變體CTH5產生的粗毒素毒力顯著下降。

3 討論與結論

Déon等[9]從分離自橡膠樹的C. cassiicola強致病力菌株和中等致病力菌株中克隆到了完全相同的Cassiicolin基因cas，在弱致病力菌株中卻未克隆到該基因。本試驗參考Cassiicolin基因設計引物，從分離自中國橡膠樹C. cassiicola的強致病力菌株cc004中克隆到了毒素基因cc004-cas，但與cas基因存在一些差異，cc004-cas基因自ATG至TAA的DNA編碼序列大小296 bp，比cas基因多了4個堿基，有43個位點存在差異，二者DNA相似性為85%；所得cDNA全長180 bp，比cas基因cDNA序列多了3個堿基，有22個位點有差異，二者cDNA相似性為88%；所推測編碼的氨基酸59個，比cas基因編碼的氨基酸在第26位多了1個丙氨酸，且有9個位點（第7、18、21、25、26、28、29、34和40氨基酸處）有差異，二者氨基酸相似性為85%。顯示出毒素基因cas在不同菌株中存在一定的差異性，可能與不同菌株進化過程中在這些位點發生了變異有關。

從遺傳研究來看，目前研究較深入的HC-毒素[14]、HMT毒素[15]和AK-毒素[16]等的合成涉及到多個成簇基因，因此推測除了cas基因外，cassiicolin毒素的合成或許也是由基因簇控制的，其它相關基因還有哪些？這些基因在cassiicolin素毒合成過程中如何起作用？這些問題需進一步研究。

另外，本研究還獲得了該菌株的蛋白激酶CCK1突變體，測定致病力對比發現與毒素突變體引發的癥狀差異較大。（1）用菌餅接種刺傷的嫩葉時，CCK1突變體完全失去了致病力，毒素突變體卻表現出略弱于野生型的致病力。（2）用粗毒素測定致病力時，毒素突變體引發的癥狀最輕、蛋白激酶CCK1突變體次之、野生型最重，萎蔫指數分別為7.60%、19.47%和32.40%，說明毒素是C. cassiicola重要的致病因子；在野生菌株中蛋白激酶CCK1調控毒素的產生，這與其它病菌中蛋白激酶如玉米小斑病菌CHK1[17]、玉米大斑病菌STK1[18]和柑橘褐斑病菌（A. alternata）AaSLT2[19]調控毒素產生的報道一致。不同接種方法產生如此大差異的原因可能有2方面：一是毒素并非是C. cassiicola唯一的致病因子，可能在菌絲生長過程中還分泌了其它致病因子；二是蛋白激酶CCK1在C. cassiicola與寄主早期識別過程中可能起著重要作用。這樣，（1）用菌餅接種時，CCK1突變體因為缺失蛋白激酶而不能識別寄主，胞外信號傳導中斷，毒素及其它致病因子不能表達，因此失去了致病力；而在毒素突變體中毒素基因雖然被破壞，但蛋白激酶CCK1正常，病原菌能識別寄主，其它致病因子能正常合成和分泌，只是致病力因毒素被破壞而減弱。 （2）用粗毒素液接種時，不存在病原菌與寄主的識別，只有累積的毒素和其它致病因子對寄主的損傷作用；對于CCK1突變體，因缺失CCK1的調控而減弱了毒素合成或分泌能力，但能正常分泌其它致病因子（甚至分泌更多的漆酶和纖維素酶，尚未發表），所以致病性雖有下降，但仍能致病；對于毒素突變體，毒素合成受阻，但其它致病因子表達正常，所以其毒素粗提液仍能致病，但致病力因缺少毒素而更低?？傊珻. cassiicola感染寄主使其發病的程度，可能由蛋白激酶CCK1調控下的病原菌與寄主的識別、侵入、產生的毒素及其它致病因子共同來決定。

SEFA-PCR技術是王世明博士發明的一種快速擴增某已知DNA序列側翼序列的有效方法[11]。但缺點是有時因獲得片段過長，不易克隆測序，又因第二輪擴增獲得的序列兩端反向互補，也無法用第二輪擴增引物進行PCR產物測序。本次試驗巧妙地通過在用于SEFA-PCR的第二個和第三個引物序列之間、設計了1個單向測序引物克服了這一難題，使得通過SEFA-PCR技術順利獲得已知DNA序列的側翼序列變得更加容易。

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