豬圓環病毒2型LAMP檢測方法的建立

陳星瑤 張子群 王曉龍

摘 要：豬圓環病毒2型屬于圓環病毒科圓環病毒屬，是引起仔豬斷奶后多系統衰竭綜合征（PMWS）的主要病原。該病在世界范圍內廣泛流行，給我國養豬業造成一定的經濟損失。目前針對PCV-2的檢測技術還有提升的空間，因此本研究針對PCV-2 的Cap 基因高度保守的區域作為靶序列設計引物，建立了一種可快速、靈敏、特異地檢測PCV-2 的LAMP 檢測方法。

關鍵字：豬圓環病毒2型；環介導等溫擴增技術（LAMP）

豬圓環病毒2型（PCV-2）屬于圓環病毒科圓環病毒屬，是20世紀末期被發現的單鏈負股DNA病毒，病毒粒子呈二十面體對稱，無囊膜，直徑大約17 nm。PCV-2是引起仔豬斷奶后多系統衰竭綜合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的主要病原[1]。目前，該病在世界范圍內的廣泛流行已經給各國養豬業造成了巨大的經濟損失[2]。國內經過血清學和流行病學調查也證實了PCV-2感染非常嚴重[3-6]。2002年，由PCV-2感染引起的PMWS在全國各地爆發式流行，給我國養豬業造成了巨大的經濟損失[3]。PMWS已成為我國規模化豬場危害養豬生產的重要免疫抑制性疫病之一[7]。當下建立一種便捷、快速、特異的PCV-2檢測方法，以確保及時發現并采取有效措施控制PMSW的發生就顯得非常重要。

環介導恒溫擴增技術（1oop-mediated isothermal amplification， LAMP）是2000 年由日本的Notomi 等人發明的一種新穎的恒溫核酸擴增方法[8]。由于LAMP具有反應條件非常簡單、結果讀判方便，加之其敏感、特異、快速的優點，已被用于多種病原的檢測診斷[9， 10]。本研究針對PCV-2 的Cap 基因高度保守的區域作為靶序列設計引物，旨在建立一種可快速、靈敏、特異地檢測PCV-2 的LAMP 檢測方法.。

1材料和方法

1.1病毒來源

豬圓環病毒2型、豬細小病毒、豬繁殖與呼吸綜合征、偽狂犬病毒基因組以及豬瘟病毒cDNA、豬流感cDNA、口蹄疫cDNA、豬藍耳病cDNA由本實驗室分離并保存。

1.2主要試劑及儀器

Marker（DL2000，DL100）購自大連TaKaRa公司，dATP，dTTP，dCTP，dGTP均購買自大連寶生物公司。Bst DNA聚合酶，瓊脂糖，甜菜堿，鎂離子購自NEB公司；其他常規試劑均為國產分析純。

1.3引物設計及制備

應用網上Lamp引物設計軟件（PrimerExplorerV3）對Cap基因設計引物（圖1），從獲得的數百對引物中選擇評分較高的引物，送南京金斯瑞生物工程有限公司進行5'端修飾合成。

1.4 豬圓環病毒2型LAMP檢測方法的建立

豬圓環病毒2型陽性樣本測序后測定濃度，分裝備用。

配制LAMP（2×）的反應緩沖液： 1M Tris-HCl （pH8.8） 貯存液 40 mL，KCl 1.49 g ，MgSO4 1.93 g，（NH4）2SO4 2.64 g，Tween-20 2 mL，Betaine 187.4g，將上述藥品混合后加入ddH2O定容至900 mL，混勻后取900 μL，再加入100 μL的 25 mM dNTP混合液（dATP 25 μL、dCTP 25μL、dGTP 25μL、dTTP 25μL）。

配制LAMP引物混合物（100uM Primer stock）包括：FIP 20 μL，BIP 20 μL，F3 2.5 μL和B3 2.5 μL。

25 μLLAMP的反應體系：Bst DNA 聚合酶1 μL，豬圓環病毒2型DNA 2 μL，ddH2O 8.6 μL，2倍的反應緩沖液12.5 μL，引物混合物0.9 μL。

1.5 LAMP反應條件優化

反應溫度優化：根據反應體系優化策略，設置4組實驗，分別為60℃，62℃，64℃及66℃，按1.4反應體系進行實驗，反應時間為1 h，結束后各取2 μL樣品在2%瓊脂糖凝膠中進行分析。

反應時間優化：分別設置3個實驗組，時間分別為30 min，45 min和60 min，按1.4反應體系進行實驗，反應在62℃下進行，結束后各取2 μL樣品在2%瓊脂糖凝膠中分析。

1.6 LAMP靈敏度檢測實驗

將前述提取的豬圓環病毒2型DNA進行濃度測定，依次倍比稀釋成107～10-2個拷貝，按照上述1.4反應條件檢測豬圓環病毒2型LAMP引物的靈敏性。

1.7 LAMP特異性檢測實驗

以豬細小病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、偽狂犬病毒、豬瘟病毒、豬流感病毒、口蹄疫病毒、豬藍耳病病毒和水，制備DNA或cDNA作為模板，按照建立的方法進行LAMP擴增，檢測豬圓環病毒2型LAMP的特異性。

1.8染料可視化試驗

為進一步優化LAMP的反應條件，在LAMP反應結束后，加入2 μLSYBR Green Ⅰ熒光染料觀察陰性和陽性反應顏色的變化情況。

2 實驗結果與分析

2.1 LAMP反應條件優化

2.1.1溫度優化

豬圓環病毒2型LAMP引物溫度優化中，擴增60 min后電泳檢測結果如圖2所示，其中60℃，62℃和64℃有擴增條帶產生，66℃無條帶產生，陰性對照無條帶產生，因此LAMP引物擴增溫度可選擇60℃，62℃，64℃中任一溫度。

2.1.2時間優化

豬圓環病毒2型LAMP引物擴增在60℃下擴增不同時間的后核酸電泳檢測結果（見圖3）。其中擴增45 min、60 min后均有擴增條帶產生，30 min無條帶產生，因此可選擇LAMP反應 60℃下的擴增時間為45 min。

2.2 LAMP靈敏度檢測實驗

豬圓環病毒2型LAMP引物擴增不同濃度梯度基因后核酸電泳檢測結果，擴增條件為60℃，擴增時間為45 min。如圖所示：107～101個拷貝的模板均有特異性產物產生，其余無條帶產生，圖4可看出本研究所設計的LAMP引物在60℃下，擴增45 min之后最少可檢出10個拷貝的模板。

2.3LAMP特異性檢測實驗

以豬圓環病毒2型基因組為模板，使用LAMP引物在60℃下擴增45 min后核酸電泳檢測結果。由圖5可見，豬圓環病毒2型LAMP引物特異性擴增出了豬圓環病毒2型基因片段，而與其他病原并無交叉反應。

2.4染料可視化試驗

向LAMP引物擴增不同濃度梯度基因的反應產物管內加2 μl SYBR GreenⅠ熒光染料，肉眼觀察，陽性反應管顏色立刻變為黃綠色，且模板濃度不同顏色有深淺變化（圖6）。由此可見，LAMP 反應結果容易判定，臨床推廣。

3討論

豬圓環病毒根據基因型和致病性可分為PCV-1和PCV-2兩種類型，PCV1沒有致病性。系統發生分析結果表明，PCV-1和PCV-2屬于不同基因群，但其基因組仍存在較高的同源性[11]，與病毒復制相關的DNA復制起始區（Ori）和復制酶編碼基因（Rep）序列同源性分別為79.5%和82%，衣殼蛋白編碼基因（Cap）存在較大差異，同源性僅為62%[12]。

建立PCV-2的LAMP檢測方法，引物的設計是關鍵。PCV-2含有11個閱讀框，其中第一個和第二個為主要的閱讀框，各實驗室目前基因疫苗的研制主要圍繞這兩段基因序列。第一個閱讀框編碼與復制相關的酶，第二個閱讀框PCV-2 Cap基因編碼該病毒衣殼蛋白，基因N端123個堿基為信號肽編碼序列，編碼的衣殼蛋白上有病毒的主要保護性抗原位點，具有免疫原性，能引起機體產生抗體，故選取該基因進行引物設計。

LAMP技術可以保證擴增的高特異性和高效率，其依賴于能夠識別靶DNA 上6個特定區域的4條引物和一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下擴增核酸，能從僅相差一個核苷酸的基因標本中找出相應靶序列進行擴增，根據擴增與否即可判斷目的基因是否存在。

綜合文中的試驗結果，LAMP 檢測技術為豬圓環病毒2型基因的診斷提供了一種快速、便捷且特異性強、敏感性高的檢測方法，可用于豬圓環病毒2型臨床檢測，并具有非常良好的應用前景。■（編輯：何芳）

參考文獻：

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