巴西橡膠樹膠乳轉化酶HbNIN基因家族物理定位的研究

高佳佳等

摘 要 膠乳轉化酶（Invertase，Inv）是控制橡膠樹膠乳蔗糖代謝和影響膠乳（橡膠）產量的關鍵酶。已有研究證實了膠乳轉化酶屬于中性/堿性轉化酶。本研究以熱研7-33-97（2n=36）為材料制備葉片細胞染色體標本，采用熒光原位雜交技術（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）對膠乳轉化酶基因HbNIN1、HbNIN2和HbNIN3進行了染色體物理定位的初步研究。結合核型分析，初步確定HbNIN1基因位于5號染色體的長臂上，其信號位點到著絲粒的百分距離為33.1；HbNIN2基因位于2號染色體的長臂上，其信號位點到著絲粒的百分距離為 35.7；HbNIN3基因位于3號染色體的短臂上，其信號位點到著絲粒的百分距離為40.42。由此揭示了該基因家族在染色體上的位置和分布特點。

關鍵詞 巴西橡膠樹；轉化酶；HbNIN1；HbNIN2；HbNIN3；熒光原位雜交

中圖分類號 S794.1 文獻標識碼 A

Chromosome Location of HbNIN Family Gene

from Hevea brasiliensis

GAO Jiajia1，2， WANG Ying1， GAO Heqiong1， ZHU Wen1， ZHUANG Nansheng1*

1 Hainan Key Laboratory for Sustainable Utilization of Tropical Bioresource/College of Agronomy， Hainan University， Haikou，

Hainan 570228， China

2 Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract Latex invertase acts as one of the key enzymes regulating the sucrose metabolism and determining the latex yield. It is verified that latex invertase belongs to the category of neutral/alkaline invertases. In this study， chromosome specimens were prepared with immature leaves of Reyan7-33-97， FISH was used to physically locate HbNIN1、HbNIN2 and HbNIN3 gene of H. brasiliensis. The results showed that HbNIN1 gene was located on the long arm of chromosome 5， the percent distances from the gene locus to centromere was 33.1； the HbNIN2 gene was located on the long arm of chromosome 2， the percent distances from the gene locus to centromere was 35.7； the HbNIN3 gene was located on the short arm of Chromosome 3， the percent distances from the gene locus to centromere was 40.42. It reveals the location and distribution of the gene family on the chromosomes.

Key words Hevea brasiliensis； Invertase； HbNIN1； HbNIN2； HbNIN3； FISH

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.008

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）是一種重要的產膠植物，是我國熱帶、亞熱帶地區(qū)重要的經(jīng)濟作物。橡膠的生物合成是在一種特化的細胞（乳管）中進行[1]，其原料是蔗糖，而蔗糖并不能直接被利用，必須在蔗糖合酶或轉化酶的作用下才能被進一步利用。蔗糖合酶主要存在于細胞質中，在尿苷二磷酸催化下，可逆地催化蔗糖裂解為尿苷二磷酸和果糖；轉化酶（Invertase，Inv）可以催化蔗糖不可逆的裂解形成葡萄糖和果糖，是植物降解蔗糖的關鍵酶[2-4]。Barratt等[5]發(fā)現(xiàn)在糖代謝過程中轉化酶的作用要遠遠大于蔗糖合酶。根據(jù)最適酶活pH值的不同可將轉化酶分為酸性轉化酶（Acid invertase，Ac-Inv）和中性/堿性轉化酶（Neutral or alkaline invertase，N/A-Inv）兩類。Tupy[6-10]研究證實膠乳轉化酶是橡膠樹膠乳代謝的限速酶；該酶位于細胞質，最適的酶活pH值為7.25～7.40，屬于中性/堿性轉化酶，是決定橡膠膠乳產量的關鍵酶。中國熱帶農業(yè)科學院唐朝榮課題組已先后克隆了3個橡膠樹膠乳轉化酶基因的全長cDNA，其中劉術金[11]克隆了2個，分別命名為HbNIN1、HbNIN2序列，已提交GenBank（GU573728和GU573727）。而HbNIN3也已克隆出但尚未發(fā)表。劉術金[11]研究了在不同條件下HbNIN1與HbNIN2在橡膠膠乳中的表達特性。戚繼艷等[12]分析了HbNIN2基因在巴西橡膠樹嫩皮和中脈中的 RNA原位雜交。藍基賢[13]利用Western blot技術研究了在蛋白水平HbNIN2基因的表達情況。但是關于這3個基因在橡膠染色體上的具體位置尚未明確。

熒光原位雜交技術（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）是20世紀80年代末在放射性原位雜交技術的基礎上發(fā)展起來的一種非放射性分子細胞遺傳學技術。該技術除了保持其他原位雜交能夠確定探針所雜交的具體位點，精確地定位目的基因[14-l5]的特點外，還具備安全、快速、靈敏度高、檢測信號強、雜交特異性高等優(yōu)點[16]。本實驗利用熒光原位雜交技術對HbNIN1、HbNIN2及HbNIN3基因進行了物理定位。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以巴西橡膠樹無性系熱研7-33-97（2n=36）為材料制備葉片細胞染色體標本。采自海南大學（儋州校區(qū)）農學院基地。

Taq DNA聚合酶和DNA Marker購自TaKaRa公司；DNA快速純化/回收采用北京鼎國公司的DNA快速純化/回收試劑盒；果膠酶購于Serva；纖維素酶（Cellulase“Onozuka”R-10）購于Japan Yakult；地高辛切口平移試劑盒（DIG-NiCk Translation Mix for in situ probes）購于Roche公司；Jackson的Alexa Fluor 488-IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin、Alexa Fluor 488-AffiniPure Mouse Anti-Rabbit IgG、Alexa Fluor 488-AffiniPure Rabbit Anti-Mouse IgG；DAPI購于Sigma公司；引物合成由Invitrogen（上海）公司完成。

1.2 方法

1.2.1 染色體標本的制備 染色體標本的制備主要參考高和瓊[17]等的方法。將酶液濃度提高為5%纖維素酶（Lellulase“Onozuka”R-10，Japan Yakult）和4%果膠酶（Serva，Easiseal）混合液，37 ℃酶解7 h左右（根據(jù)葉片大小不同以及材料的固定時間不同，酶解時間有所差異）。

1.2.2 基因片段的PCR擴增與回收 本研究用于HbNIN基因家族基因片段擴增的DNA模板及引物序列均由中國熱帶農業(yè)科學院橡膠研究所唐朝榮課題組惠贈（表1）：包括用于HbNIN1、HbNIN2基因組片段擴增的基因組DNA和引物，以及用于HbNIN3基因擴增的cDNA及引物。經(jīng)如下程序擴增：94 ℃ 3 min，94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 3.5 min，35個循環(huán)，72 ℃ 10 min。將擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。之后采用北京鼎國公司的DNA快速純化/回收試劑盒對擴增片段進行純化回收，具體操作參照產品說明書。由于HbNIN3基因序列未發(fā)表，暫時不便公布序列及引物信息。

1.2.3 探針的制備 采用Roche公司的地高辛切口平移試劑盒（DIG-Nick Translation Mix for in situ Probe）標記制備探針，具體操作參照產品說明書進行。參考盧圣棟[18]乙醇沉淀純化法純化探針。探針標記完成后，向20 μL探針標記反應液中加入10 mg/mL E.coli tRNA 2 μL、10 mg/mL鮭魚精DNA 2 μL和4 mol/L醋酸銨2.5 μL，然后加入2倍體積預冷的無水乙醇，混勻后稍離心，置于-70 ℃ 3 h以上。4 ℃下13 000 r/min離心20 min，沉淀探針DNA，去上清，室溫下干燥DNA，再用去離子甲酰胺溶解探針，使探針終濃度為50 ng/μL。

1.2.4 熒光原位雜交 參照邱海燕[19]的方法進行熒光原位雜交。為了提高信號檢出率作者對FISH的操作過程稍作修改：染色體標本進行預處理中用0.01 mol/L HCl溶液取代2×SSC溶液；采用Alexa Fluor 488抗體代替FITC抗體；將雜交后的洗脫時間延長至10 min。

1.2.5 圖象檢測與分析 用熒光顯微鏡觀察，Penguin/Proseries Camera systems軟件拍照，用Photoshop軟件進行圖片處理。根據(jù)王靜暉等[20]報道的擴增信號位點的百分距離的計算方法結合核型分析確定信號位點在染色體上的具體位置。具體計算方法如下：

擴增信號位點的百分距離=

×100

2 結果與分析

2.1 目的片段的擴增

采用中國熱帶農業(yè)科學院橡膠研究所唐朝榮課題組惠贈的引物，以巴西橡膠樹基因組為模板，對HbNIN1、HbNIN2基因基因組片段進行擴增；采用惠贈的模板cDNA及引物進行HbNIN3基因片段的擴增（圖1）。HbNIN1基因基因組片段長度為950 bp左右（泳道1）；HbNIN2基因基因組片段長度為950 bp左右（泳道3）；HbNIN3基因片段長度為2 000 bp左右（圖1泳道5）。并對HbNIN1、HbNIN2擴增片段進行測序，對測得序列與HbNIN1、HbNIN2基因基因組全長進行BLAST比對，比對結果顯示片段相似性都達99%，這就說明這兩段擴增序列確實為HbNIN1、HbNIN2基因組片段。并對HbNIN1、HbNIN2、HbNIN3擴增片段進行相互比對，結果顯示兩兩序列之間沒有相似性，可制備FISH所用探針進行3個基因的物理定位分析。

2.2 探針標記的檢測

本研究使用切口平移試劑盒進行探針的標記，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1）。結果顯示：標記后的探針呈彌散的條帶，片段大小主要集中在200～600 bp，且條帶分布均勻。這就說明擴增片段已經(jīng)被成功地標記，標記后的探針長度適宜且分布較均勻，能夠用于后續(xù)的熒光原位雜交。

2.3 HbNIN基因家族FISH結果與分析

HbNIN基因家族在熱研7-33-97有絲分裂不同時期的葉片細胞中均可檢測到雜交信號，其中以出現(xiàn) 2個雜交信號居多。以高和瓊[21]等報道的熱研7-33-97的核型為依據(jù)，對這些含有雜交信號位點的中期細胞進行核型分析，得到了如圖2-C、圖3-C和圖4-C所示的核型圖，以及如圖5所示的核型模式圖。HbNIN1基因位于5號染體的長臂上，其信號位點到著絲粒的百分距離為33.1（圖2-C、圖5）；HbNIN2基因位于2號染色體的長臂上，其信號位點到著絲粒的百分距離為35.7（圖3-C、圖5）；HbNIN3基因位于3號染色體的短臂上，其信號位點到著絲粒的百分距離為40.42（圖4-C、圖5）。

2.4 巴西橡膠樹熱研7-33-97核型模式圖

根據(jù)高和瓊[21]得到的巴西橡膠樹熱研7-33-97的核型數(shù)據(jù)制作核型模式圖，圖5為本研究定位的3個基因HbNIN1、HbNIN2、HbNIN3基因在熱研7-33-97的染色體上的位置分布，由圖5可知，3個基因位于3條不同的染色體上因此為獨立基因。

2.5 信號檢出率統(tǒng)計結果

為了保證結果的準確性，本研究在進行了HbNIN1、HbNIN2及HbNIN3基因的雜交時都觀察了350個以上的細胞，并對觀察結果進行了簡單的統(tǒng)計分析，具體分析結果見表2。由表2可以看出，3個基因的信號檢出率都在20%以上，且在所有能夠檢出信號的細胞中，有2信號位點的細胞占80%左右，也有少部分細胞出現(xiàn)1個信號點及3個信號點的現(xiàn)象。

3 討論與結論

探針一直是影響雜交效果的重要因素之一，對于基因家族的雜交定位來講，如何通過設計不同的探針來進行各家族成員之間的有效區(qū)分，是需要首要考慮的問題之一。膠乳轉化酶HbNIN1、HbNIN2和HbNIN3同屬于膠乳轉化酶HbNIN基因家族，其中HbNIN1、HbNIN2的cDNA之間同源相似性很高，達到98%，而HbNIN3與HbNIN1、HbNIN2之間沒有同源性。劉術金[11]在進行HbNIN1、HbNIN2的Southern雜交時，就選用這2個基因同源性最低的基因組片段進行探針引物的設計，并以橡膠樹基因組DNA為模板，成功地擴增出這2個基因的基因組片段，但由于Southern雜交的實驗條件不夠優(yōu)化，導致結果不夠理想，只能推測這2個基因為單低拷貝基因。本研究繼續(xù)采用劉術金設計的探針引物，擴增出HbNIN1、HbNIN2基因組片段與劉術金所擴增片段結果一致。擴增片段測序后經(jīng)比對證實這2個探針片段的確來自HbNIN1、HbNIN2基因組全長，且2個片段之間沒有相似性，可以用于FISH制備探針。而由于同家族的HbNIN3基因與HbNIN1、HbNIN2基因之間沒有同源性，因此可以直接以HbNIN3的cDNA序列制備探針進行該基因的物理定位研究。探針的長度也是影響雜交效果的因素之一，適宜長度的探針，能夠穿透組織，順利接近靶位置，與靶序列形成穩(wěn)定雙鏈，而且形成的雜交體受環(huán)境影響小，不易被洗脫。李璇[22]認為探針長300～500 bp時可達到最大的雜交率。余朝文[23]認為探針長度在300 bp左右的雜交效果較好。本研究采用切口平移法進行探針的標記，標記后探針長度主要集中在200～600 bp之間，能夠用于后續(xù)的熒光原位雜交。

本研究對3個HbNIN家族基因進行物理定位的結果進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，在所有能夠檢測到信號的細胞中，有2信號位點的細胞占80%左右，因此認為這3個基因都應該屬于單拷貝基因，這與劉術金的推測是一致的。而有1個信號位點及3個位點的細胞約占所有能夠檢出信號細胞的16%及4%。筆者認為這些可能為不理想的雜交結果，并初步分析了出現(xiàn)這些不理想現(xiàn)象的原因：（1）出現(xiàn)多個信號主要是因為非特異性雜交或未雜交上的探針分子，沒有在雜交后的洗脫中被順利除去，造成了假陽性的信號干擾。榮小營[24]認為雜交后的洗脫是提高信號檢出率的重要因素之一，因此應選擇適宜的洗脫時間。（2）出現(xiàn)1個雜交信號可能的原因：一是DNA變性不太成功，導致探針無法順利與靶序列結合；二是洗脫時間可能過長，把與靶序列結合的探針洗脫下來，造成信號點少甚至沒有信號點的現(xiàn)象；三是有細胞壁和細胞質碎片的存在，使探針與靶序列雜交相當困難，同時熒光信號一般為小圓點，非常容易猝滅，因此要及時捕捉雜交信號也是不容易的[25]，因此制備出背景較干凈的葉片細胞染色體標本至關重要。為了提高有效的雜交信號的檢出率，根據(jù)前期試驗所出現(xiàn)的問題，對雜交條件做了部分調整，挑選了更為優(yōu)質的標本，延長了標本變性的時間，選擇了更為適合的洗脫時間。通過這些調整，有效地提高了雜交信號的檢出率，達到了較為理想的效果。

研究表明，橡膠樹膠乳轉化酶活性和橡膠樹膠乳產量有很大的相關性，是影響膠乳代謝和再生的關鍵酶之一[10]，因此膠乳轉化酶基因在橡膠樹乳管蔗糖代謝和膠乳再生調控中具有舉足輕重的地位。本研究利用FISH技術將HbNIN1、HbNIN2和HbNIN3分別定位于巴西橡膠樹熱研7-33-97的第5號、第2號和第3號3條不同的染色體上。研究結果表明，這3個基因互為獨立基因，其中HbNIN1基因與高和瓊[26]定位的死皮病基因HbMyb1都位于5號染色體的長臂上，兩者為連鎖基因且兩者之間的距離為17.89；HbNIN3基因與邱海燕[19]定位的REF基因也是連鎖基因，但前者位于熱研7-33-97第3號染色體短臂上，后者位于長臂上；而HbNIN2基因目前并未找到與之連鎖的基因。通過對HbNIN基因家族進行物理定位有助于進一步了解該家族基因的位置關系、分布特點，及與其他基因的關系，確定現(xiàn)有的橡膠遺傳圖譜的準確性及完整性，為染色體微切割，建立含轉化酶基因的特定染色體片段的基因文庫，進而分離和利用這些基因提供某些依據(jù)，同時還可以為橡膠樹遺傳育種、基因工程以及比較基因組學研究提供分子細胞遺傳學依據(jù)。

參考文獻

[1] 劉術金， 李旖璠， 唐朝榮. 橡膠樹2個膠乳轉化酶基因的原核表達[J]. 熱帶作物學報， 2010， 31（7）： 1 091-1 097

[2] Sturm A. Molecular characterization and functional analysis of sucrose-cleaving enzymes in carrot（Daucus carota L）[J]. Joutnal of Experimental Botany， 1996， 47： 1 187-1 192.

[3] Tymowska-Lalanne Z， Kreis M. The Plant Invertases： Physiology， Biochemistry and Molecular Biology[J]. Advance in Botany Research， 1998， 28： 71-117.

[4] Winter H， Huber S C. Regulation of sucrose and regulation of activity of key enzymes[J]. Crit Rev Plant Sci， 2000， 19（1）： 31-67.

[5] Barratt D H P， Derbyshire P， Findlay K， et al. Normal growth of Arabidopsis requires cytosolic invertase but not sucrose synthase[J]. PNAS， 2009， 106： 13 124-13 129.

[6] Tupy J. Stimulatory effects of 2，4-dichlorophenoxyacetic acid and of 1-naphthylacetic acid on sucrose level， invertase activity and sucrose utilization in the latex of Hevea brasiliensis[J]. Planta， 1969， 88（2）： 144-153.

[7] Tupy J. The regulation of invertase activity in the latex of Hevea brasiliensis Muell[J]. J Exp Bot， 1973， 24（3）： 516-524.

[8] Tupy J， Peimot L. Control of carbohydrate metabolism by ethylene in latex vessels of Hevea brasiliensis Muel. ARC in relation to rubber production[J]. Biologia Plantarum， 1976， 18（5）： 373-383.

[9] Tupy J. Some aspects of sucrose transport and utilization in latex producing bark of Hevea brasiliensis Muel Arg[J]. Biologia Plantarum， 1985， 27（1）： 51-64.

[10] Tupy J. Sucrose supply and utilization for latex production[M]. In： Physiology of Rubber Tree Latex， D'Azuac J and Chrestin H， eds， Boca Raton： CRC Press， 1988.

[11] 劉術金. 橡膠樹膠乳中性/堿性轉化酶基因的克隆及其表達特性研究[D]. 海口： 海南大學， 2010.

[12] 戚繼艷， 周斌輝， 曹 冰， 等. HbNIN2基因在巴西橡膠樹嫩皮和中脈中的RNA原位雜交分析[J]. 熱帶作物學報， 2013， 34（10）： 1 914-1 918.

[13] 藍基賢. 橡膠樹膠乳轉化酶的分離純化、 生化特性與表達分析[D]. 海口： 海南大學， 2012.

[14] Nelson D L， Ledbtter S A， Corbo L， et al. Alu polymeras chain reation： a method for rapid isolating of human specific sequence from complex DNA sources[J]. Pro Nati Acad Sci USA， 1989（86）： 6 686-6 690.

[15] 吳 剛， 崔海瑞， 夏英武. 原位雜交技術在植物遺傳育種上的應用[J]. 植物學通報， 1999， 16（6）： 625-630.

[16] Stephens J L， Brown S E， Lapitan N L V， et al. Physical mapping of barley genes using an ultrasensitive fluorescence in situ hybridization technique[J]. Genome Ottawa， 2004， 47（1）： 179-190.

[17] 高和瓊， 王 英， 金 鴿， 等. 橡膠樹葉片染色體制片方法的優(yōu)化[J]. 熱帶作物學報， 2009（5）： 565-568.

[18] 盧圣棟. 現(xiàn)代分子生物學實驗技術[M]. 北京： 中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社， 1999， 193.

[19] 邱海燕. 巴西橡膠樹REF、 RT和SRPP基因物理定位的研究[D]. 海口： 海南大學， 2010.

[20] 王靜暉， 宋運淳， 杭 超， 等. 玉米大斑病抗性基因ht2的原位雜交物理定位[J]. 武漢大學學報， 1998， 44（4）： 465-468.

[21] 高和瓊， 莊南生， 王 英， 等. 橡膠樹兩個品種的核型分析[J]. 武漢植物學研究， 2009， 27（5）： 537-540.

[22] 李 漩， 忽偉軍， 李常寶， 等. 基因組原位雜交中探針長度的優(yōu)化[J]. 中央民族大學學報（自然科學版）， 2002， 11（1）： 63-66.

[23] 余朝文.幾種植物與模式植物基因組的分子細胞遺傳學比較分析[D]. 武漢： 武漢大學博士學位論文， 2005.

[24] 榮小營.甘藍自交不親和性信號傳導元件MLPK與SSP編碼基因的FISH定位研究[D]. 重慶： 西南大學碩士學位論文， 2009.

[25] Ning S B， Song Y C， Wang L. Maize nac1 and cld genes map to chromosome arms 10 L and 2 S， and to 4 L and 5 L， respectively[J]. Chromosome Research， 2000， 8： 273.

[26] 高和瓊， 莊南生， 王 英， 等. 巴西橡膠樹HbMyb1基因的原位PCR物理定位[J]. 熱帶亞熱帶植物學報， 2012， 20（4）： 365-368.