布氏艾美耳球蟲保定株早熟系的免疫原性研究

廖貴城 劉麗丹 王文莉等

摘 要：經過20代的選育，選育出了布氏艾美耳球蟲保定株早熟系蟲株，該早熟系蟲株與親本株均對常見的抗球蟲藥物——克球素、地克珠利、磺胺喹惡啉和尼卡巴嗪高度敏感，敏感性與保定親本株一致；分別接種200個該早熟系蟲株和親本株孢子化卵囊，21d后雞群均能抵抗1.0×105個布氏艾美耳球蟲強毒株孢子化卵囊的攻擊，說明早熟株仍然保持良好的免疫原性。

關鍵詞：布氏艾美耳球蟲保定株；早熟株；藥物敏感性；免疫原性

中圖分類號：S858.312.72+3 文獻標識碼：B 文章編號：1673-1085（2014）09-0016-04

雞球蟲病是集約化養雞場中流行普遍、發病率高、危害嚴重的疾病之一[1]。布氏艾美耳球蟲（Eimeria. brunetti）在國內外流行較為廣泛，屬中等致病力蟲種，可明顯地降低雞的飼料轉化率和增重，對雞的生產性能有較強的影響[2，3]。目前雞球蟲病疫苗是防控該疾病的主要手段，國內市面上銷售的主要是正典雞球蟲病三價、四價疫苗，而包含布氏艾美耳蟲種的疫苗產品只有先靈葆雅公司的八價種雞球蟲活疫苗[1]。本公司采用Jeffers法，經過20代的早熟選育，選育出了布氏艾美耳球蟲保定株早熟系蟲株，該蟲株潛隱期為88h，平均大小為24.4μm×20.0μm，形狀指數為1.22，與親本株一致，繁殖力和致病力顯著低于親本株[3，4，5]。為此，我們將該早熟系蟲株進行免疫原性測定，評價該蟲株是否可作為疫苗的候選蟲種。

1 材料和方法

1.1 材料 布氏艾美耳球蟲保定株，布氏艾美耳球蟲保定株早熟系蟲株和布氏艾美耳強毒株由佛山市正典生物技術有限公司保存[3]；1日齡無球蟲感染嶺南黃雞購自廣東省農業科學院畜牧研究所種雞場；無添加抗球蟲藥物和抗生素的全價飼料購自中山市某飼料公司；克球素，成分為6%葵氧喹酯預混劑，購自廣州市科虎生物技術公司；球安，成分為拉沙洛菌素，購自河南大中農動物藥業有限公司；地克珠利，0.5%預混劑，購自杭州豐禾生物技術有限公司；磺胺喹惡啉由佛山市正典生物技術有限公司提供；尼卡巴嗪，購自山東魯西獸藥股分有限公司。

1.2 方法

1.2.1 布氏艾美耳球蟲保定株的親本株和早熟系蟲株藥物敏感性試驗

1.2.1.1 將7日齡的無球蟲感染雞隨機分成7組，每組10羽；除第6、7組外，其它5組分別于飼料或飲水中添加克球素、球安、地克珠利、磺胺喹惡啉和尼卡巴嗪。飼養1d后，第1～6組的每組雞感染布氏艾美耳球蟲保定株親本株孢子化卵囊1000個/羽，隔離飼養。分別收集感染后96～192h的糞便。用麥克馬斯特方法（Mcmaster method）分別計數各組雞糞便中排出的卵囊數。以同樣的分組處理，第1～6組的每組雞感染布氏艾美耳球蟲保定株的早熟株孢子化卵囊1000個/羽，隔離飼養。分別收集感染后96～192h的糞便。藥敏試驗見表1。

1.2.1.2 藥物敏感性評定指標：以相對卵囊產量（ROP=感染用藥組排出的卵囊總數/感染不用藥組的卵囊總數×100%）作為判定球蟲對藥物抗藥性的指標；當ROP≥5%，則判定為耐藥；當ROP≤5%，則判定為敏感。

1.2.2 布氏艾美耳球蟲保定株早熟株免疫原性

1.2.2.1 將雞隨機分成4組，每組10羽，第1組為陰性對照組，不免疫不攻蟲；第2組為陽性組，不免疫攻蟲組；第3、4組為免疫組，第3組于4日齡經口免疫200個布氏艾美耳球蟲早熟株孢子化卵囊，第4組于4日齡經口免疫200個布氏艾美耳球蟲保定株孢子化卵囊。置實驗室平養，地上鋪上木糠作為墊料。25日齡時，第2、3、4組雞每羽口服攻擊1×105個布氏艾美耳球蟲強毒孢子化卵囊，攻蟲后觀察6～7d，記錄各組雞的糞便、精神狀況和飲食欲，第7天各試驗組稱重并剖殺，作病變記分。

1.2.2.2 免疫原性評價標準：糞便記分標準及腸道病變記分；試驗雞攻蟲前后增重情況，相對增重率=各試驗組的平均增重/陰性對照組的平均增重×100%；免疫保護率。

2 結果

2.1 藥物敏感性 布氏艾美耳球蟲保定株的親本株和早熟株藥物敏感試驗結果見表2。

由表2可知，除了球安用藥組外，親本株和早熟株的其它各用藥組的相對卵囊產量（ROP）均≤5%，該蟲株的親本株和早熟株對球安之外的4種藥物均敏感。

2.2 免疫原性

2.2.1 雞增重情況 見表3。

由表3增重結果可見，攻蟲后兩個免疫組雞的相對增重稍低于陰性組，但明顯高于陽性組；陽性組雞受強毒卵囊攻擊后增重受影響，而免疫了布氏艾美耳球蟲早熟株和親本株的雞相對增重率相近，說明免疫后能產生一定的免疫力，當用強毒攻擊時，對雞體的影響小于未接受免疫的雞。

2.2.2 糞便記分、腸道病變記分及保護率 攻蟲后6d，陽性組雞的糞便明顯出現異常，發病雞拉稀、糞便呈黃色水樣，雞只飲食欲下降、精神沉郁、打堆、兩翅下垂，腳脫水干癟；早熟株免疫組和親本株免疫組雞糞便正常或含較多水分，雞只精神良好，有正常飲食，無明顯臨床發病癥狀。表4腸道平均病變記分的結果顯示，免疫組雞攻蟲后病變明顯低于陽性組，用早熟系蟲株和親本株分別免疫后可以抵抗1×105個強毒孢子化卵囊的攻擊。

3 分析與討論

3.1 藥物敏感性 早熟株對球蟲的抗藥性與親本株比較，雖然早熟株每羽雞的排卵囊數量與低于保定親本株，但相對卵囊產量即感染用藥組與感染不用藥組的比率，顯示早熟株與保定株的藥物敏感性是一致的，早熟株和保定親本株都對球安有耐藥性，對其余四種藥物敏感，說明早熟株具有保定親本株的遺傳特性。

3.2 免疫原性 通過免疫攻蟲試驗結果可見，早熟株與保定株同樣免疫劑量免疫21d后，能夠抵抗1×105個布氏艾美耳球蟲強毒孢子化卵囊的攻擊，陽性組糞便記分為3分，糞便呈水樣且含淡黃色粘液，而兩免疫組的糞便無明顯異常；陽性組平均病變記分為3.2分，兩個免疫組腸道平均病變記分均小于1分，從攻蟲后增重、糞便記分及病變記分結果表明陽性組與免疫組的差異顯著，說明經過早熟選育之后，早熟株具有良好的免疫原性。胡景輝等研究指出，當免疫500個布氏艾美耳球蟲孢子化卵囊時，該蟲株的免疫效果最好[6]；而在本研究中，當接種劑量為200個時，就可以獲得理想的免疫保護效果。一般認為子孢子和第一代裂殖體是球蟲產生免疫最重要的階段，早熟株是球蟲在發育史中最后一代裂殖生殖發生缺乏或缺陷，因而早熟系的免疫原性不會因為早熟選育而產生影響[7]。本研究結果表明布氏艾美耳球蟲早熟系蟲株能使雞群建立良好的抗布氏艾美耳強毒株免疫力，是雞球蟲病活疫苗理想的候選蟲株。

參考文獻：

[1] 翁亞彪.雞球蟲病疫苗應用前景[J].養禽與禽病防治，2009，1：2-3.

[2] 陳桂先，劉明如，陳漢忠，等.布氏艾美耳球蟲南寧株的分離及鑒定[J].中國畜牧獸醫，2011，38（11）：222-226.

[3] 劉麗丹，廖貴城，王文莉，等.布氏艾美耳球蟲保定株的鑒定及致病性研究[J].中國畜牧獸醫， 2013，40（8）：173-175.

[4] 廖貴城，劉麗丹，吳松明，等.布氏艾美耳球蟲保定株早熟系的選育及致病性研究[J].家禽科學，2014，5：15-18.

[5] 王時偉.布氏艾美耳球蟲及其早熟株生物學特性的研究[D].烏魯木齊：新疆農業大學，2004.

[6] 胡景輝，趙永前，李紅斌，等.布氏艾美耳球蟲（Eimeria brunetti）早熟蟲株的免疫原性及毒力[J].中國獸醫學報，1998，18（5）：483-485.

[7] 索勛.雞球蟲病學[M].北京：中國農業大學出版社，1998.□