高效液相色譜法檢測非洛地平緩釋片中的氧化產(chǎn)物

呂治紅,賀麗娟,霍建富

(山西康寶生物制品股份有限公司，山西 長治 046011)

非洛地平為一種二氫吡啶鈣通道拮抗劑，通過選擇性地擴張動脈阻力血管，產(chǎn)生與劑量有關(guān)的血管阻力降低，對心肌收縮力與心率無明顯影響，不引起體位性低血壓。其制劑非洛地平緩釋片，半衰期近24 h，給藥方便，降壓效果較好且副作用輕微，具有良好的耐受性和順從性[1]，是國內(nèi)高血壓患者廣泛使用的降壓藥。非洛地平氧化產(chǎn)物4-(2,3-二氯苯基)-2,6-二甲基吡啶-3,5-二羧酸乙基甲基酯是非洛地平緩釋片的主要雜質(zhì)，準(zhǔn)確測定其含量對保證該藥品的有效性具有重要的意義。作者在此建立了非洛地平緩釋片中氧化產(chǎn)物的高效液相色譜檢測方法。

1 實驗

1.1 試藥、試劑與儀器

非洛地平緩釋片(規(guī)格：2.5 mg/片，批號：101001、101002、101003、100907、100908、100909)，山西康寶生物制品有限公司；氧化產(chǎn)物(H152/37)對照品(批號：1269390)，USP REFERENCE STANDARD。

乙腈、甲醇，色譜級，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；磷酸，分析純，天津凱通化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鈉，分析純，天津北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司。

AE240型電子分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；LC-10ATvp型高效液相色譜儀、SPd-10Avp型紫外檢測儀，日本島津公司；C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)。

1.2 系統(tǒng)適用性實驗

色譜條件：C18色譜柱，檢測波長 254 nm，流動相為pH值3.0的乙腈-甲醇-磷酸鹽緩沖溶液(取1 mol·L-1磷酸溶液8.0 mL、1 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液50.0 mL，用水稀釋至1000 mL)(2∶1∶2)，流速1.5 mL·min-1，進樣量20 μL。取氧化產(chǎn)物對照品適量，用流動相溶解并定量稀釋成3 μg·mL-1的溶液，進樣，記錄色譜圖，進行色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗。

1.3 供試品溶液的制備

取非洛地平緩釋片10片，精密稱定，研細(xì)；精密稱取適量細(xì)粉(約相當(dāng)于非洛地平5 mg)，置50 mL量瓶中，加乙腈20 mL、甲醇10 mL，超聲處理5 min；加pH值3.0的磷酸鹽緩沖溶液15 mL，超聲處理至非洛地平緩釋片溶解，放冷，用pH值3.0的磷酸鹽緩沖溶液稀釋至刻度，搖勻，離心，取上清液，經(jīng)濾膜(0.45 μm)濾過，精密量取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取氧化產(chǎn)物對照品適量，用流動相溶解并制成30.5 μg·mL-1的溶液，作為貯備液；精密量取貯備液0.5 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL分別置于100 mL、10 mL、10 mL、10 mL、10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，配制成0.1525 μg·mL-1、1.525 μg·mL-1、3.050 μg·mL-1、4.575 μg·mL-1、6.100 μg·mL-1的溶液；按1.2色譜條件分別進樣測定，以樣品濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 檢測限與定量限的確定

在1.2色譜條件下，取氧化產(chǎn)物對照品溶液逐級稀釋進樣。按儀器噪音的10倍響應(yīng)值測定定量限；按儀器噪音的3倍響應(yīng)值測定檢測限。

1.6 重復(fù)性實驗

取氧化產(chǎn)物對照品適量，用流動相分別制成2.44 μg·mL-1、3.05 μg·mL-1、3.66 μg·mL-1的對照品溶液，連續(xù)進樣3次，記錄色譜圖，計算峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.7 回收率實驗

取適量(約相當(dāng)于非洛地平5 mg)非洛地平緩釋片(批號：101001)細(xì)粉9份，置50 mL量瓶中，分別加入乙腈20 mL、甲醇10 mL，超聲處理5 min，加pH值3.0的磷酸鹽緩沖溶液10 mL，超聲處理30 min，使非洛地平溶解，放冷。再分別加入氧化產(chǎn)物對照品貯備液(30.5 μg·mL-1)3 mL、4 mL、5 mL，制成氧化產(chǎn)物低、中、高三個濃度的供試液各3份。用pH值3.0的磷酸鹽緩沖溶液稀釋至刻度，搖勻，離心，取上清液，經(jīng)濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液進樣測定，計算回收率。

1.8 溶液穩(wěn)定性

取氧化產(chǎn)物對照品適量，用流動相制成3 μg·mL-1的供試液，于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h取樣，在1.2色譜條件下進樣測定，計算平均峰面積及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(%)。

1.9 樣品測定

取6批非洛地平緩釋片制得供試品溶液；取氧化產(chǎn)物(H152/37)對照品適量，用流動相溶解并定量稀釋成3 μg·mL-1的溶液，作為對照品溶液；精密量取供試品溶液和對照品溶液各20 μL進樣測定，記錄色譜圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性

在1.2色譜條件下，理論板數(shù)為8101.129、拖尾因子為1.054，基本符合《中國藥典》2010年版二部[2]的有關(guān)規(guī)定。取處方量的空白輔料，進樣測定。結(jié)果表明輔料對氧化產(chǎn)物測定無干擾。

對非洛地平緩釋片(批號：101001)進行酸、堿、加熱、氧化和光照的破壞實驗，結(jié)果非洛地平緩釋片在各種破壞條件下均不穩(wěn)定，但氧化產(chǎn)物與主成分及降解產(chǎn)物的分離度均符合測定要求。綜合上述結(jié)果，確定1.2色譜條件適于非洛地平緩釋片中氧化產(chǎn)物檢測。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)

圖1 氧化產(chǎn)物(H152/37)標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1擬合得線性回歸方程為：y=9687.9x-59.887，R2=0.9999。氧化產(chǎn)物的濃度在0.1525～6.100 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3 檢測限與定量限

實驗結(jié)果表明，氧化產(chǎn)物的檢測限為0.61 ng，定量限為1.83 ng。

2.4 重復(fù)性(表1)

表1 氧化產(chǎn)物重復(fù)性實驗結(jié)果

由表1可知，3個濃度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于1%，說明本方法的重復(fù)性較好。

2.5 回收率(表2)

由表2可知，氧化產(chǎn)物平均回收率為98.43%，RSD為0.59%。

2.6 溶液穩(wěn)定性(表3)

由表3可知，在24 h內(nèi)溶液穩(wěn)定性較好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于1%。

2.7 樣品測定結(jié)果

供試品溶液的色譜圖中， 如出現(xiàn)與對照品溶液相應(yīng)的氧化產(chǎn)物(H152/37)色譜峰，其含量不得超過非洛地平標(biāo)示量的3.0%。6批樣品氧化產(chǎn)物測定結(jié)果見表4。

表2 氧化產(chǎn)物回收率實驗結(jié)果

表3 氧化產(chǎn)物溶液穩(wěn)定性實驗結(jié)果

由表4可知，6批樣品氧化產(chǎn)物含量均符合要求。

2.8 討論

考察了流速對色譜行為的影響，結(jié)果見表5。

表4 6批樣品氧化產(chǎn)物測定結(jié)果

表5 流速對色譜行為的影響

由表5可知，不同流速下的分離度均符合測定要求，但流速為1.5 mL·min-1時，保留時間短。因此，選擇流速為1.5 mL·min-1。

3 結(jié)論

建立了非洛地平緩釋片中氧化產(chǎn)物的高效液相色譜檢測法。色譜條件：C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為pH值3.0的乙腈-甲醇-磷酸鹽緩沖溶液(2∶1∶2)，檢測波長254 nm，流速1.5 mL·min-1，檢測濃度3 μg·mL-1，進樣量20 μL。氧化產(chǎn)物濃度在0.1525～6.100 μg·mL-1的范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，檢測限為0.61 ng，定量限為1.83 ng；重復(fù)性實驗相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于1%；平均回收率為98.43%。此方法重復(fù)性好、穩(wěn)定性高，適合非洛地平緩釋片中氧化產(chǎn)物的測定。

參考文獻：

[1] 朱兵成.非洛地平緩釋片治療老年高血壓72例臨床分析[J].淮海醫(yī)藥,2009,27(1):54-55.

[2] 《中國藥典》國家藥典委員會.中國藥典2010年版(二部)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：29-31.