固相萃取—高效液相色譜法同時測定發(fā)酵豆制品中4種大豆異黃酮

曠勇　盧成瑛　龔竹瓊　昌海

摘要[目的]采用固相萃取-高效液相色譜法同時測定大豆發(fā)酵制品中的異黃酮含量。[方法] 以乳酸、霉菌發(fā)酵大豆樣品為試材，將發(fā)酵豆制品以60%的乙醇溶液超聲波提取1 h，稀釋后用SPE小柱做凈化處理，以C18反相色譜柱（4.6 mm×250.0 mm，5.0 μm），0.2%甲酸和乙腈進行梯度洗脫、流速為1.2 ml/min、紫外檢測波長260 nm，同時測定4種大豆異黃酮含量。[結(jié)果]試驗得出，發(fā)酵豆制品中4種大豆異黃酮的平均回收率分別為大豆甙96.7%、染料木甙97.9%、大豆甙元102.2%、染料木素103.1%。[結(jié)論]該方法可同時測定發(fā)酵豆制品中4種大豆異黃酮成分，數(shù)據(jù)準確，重現(xiàn)性好。

關(guān)鍵詞 固相萃取；高效液相色譜；發(fā)酵豆制品；大豆異黃酮

中圖分類號S509.9；O657.7+2文獻標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）04-01178-03

作者簡介曠勇（1983-），男，湖南株洲人，工程師，從事天然食品添加劑產(chǎn)品研究開發(fā)。

大豆異黃酮（ISO）是大豆中的一類重要的非營養(yǎng)素成分，主要活性成分為葡萄糖甙-金雀異黃甙和大豆甙及其相應(yīng)金雀異黃素（又稱染料木素）和大豆素。經(jīng)過研究，發(fā)現(xiàn)大豆異黃酮的生理活性有抗氧化、抗腫瘤、提高雌激素水平、減少動脈硬化、改善心血管功能、抗骨質(zhì)疏松等功效[1-3]。并且有文獻資料指出，大豆異黃酮中異黃酮甙元比異黃酮葡萄糖甙更容易被人體吸收[4-5]，同時，異黃酮甙元具有較強的抗氧化活性和對癌細胞增殖的特異性抑制作用，因此異黃酮甙元被認為是大豆異黃酮中具有預(yù)防和治療癌癥最有效的形式[6]。

發(fā)酵豆制品是湘西地區(qū)的一種傳統(tǒng)發(fā)酵食品，并且有研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵豆制品中異黃酮糖甙在微生物和酶的作用下大部分能轉(zhuǎn)化為甙元[7-8]。但發(fā)酵豆制品中大豆異黃酮的測定方法還很少，雖有研究者進行發(fā)酵液中大豆異黃酮的糖甙類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為甙元的測定[9-10]，但由于豆制品經(jīng)發(fā)酵后成分復(fù)雜，使得樣品中雜質(zhì)去除率不高，對液相色譜柱損耗很大，并且分離度不好。筆者以乳酸、霉菌發(fā)酵大豆樣品為研究材料，選用SPE固相萃取凈化，以液相色譜梯度洗脫測定[11-13]，建立了一種分離度好、對色譜柱損耗小、能同時測定4種大豆異黃酮的檢測方法。

1 材料與方法

1.1材料樣品：經(jīng)乳酸、霉菌發(fā)酵的豆豉及發(fā)酵前原料。主要儀器：LC20A島津高效液相色譜儀；配有二極管陣列檢測器；1/100 000天平；超聲波清洗器；渦旋振蕩器；樣品搗碎機；高速離心機；固相萃取裝置。標(biāo)準品：大豆甙（純度≥98%）、染料木甙（純度≥98%）、大豆甙元（純度≥98%）、染料木素（純度≥98%），上海順勃生物工程技術(shù)有限公司。主要試劑：甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、乙醇（分析純）、超純水。SPE小柱：CLEANUPCEC18156、美國SEPAX、500 mg/6 ml。

1.2標(biāo)準溶液的配制 于1/100 000天平分別精密稱取大豆甙、染料木甙、大豆甙元、染料木素的標(biāo)準物質(zhì)為7.37、7.73、8.77、9.22 mg，用色譜純甲醇定容至10 ml，至冰箱保存。使用時稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準工作液。

1.3試驗方法

1.3.1 樣品的制備。將發(fā)酵豆豉置于玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)，于80 ℃烘箱烘至恒重，用組織破碎機搗碎，備用。將樣品用搗碎機搗碎，準確稱取約5 g左右的粉末樣品，置于50 ml刻度試管中，先加入25 ml 60%的乙醇[14-15]，然后補加60%乙醇至40 ml的刻度，30 ℃，超聲1 h。將超聲好的樣液，用60%的乙醇定容至50 ml，搖勻，倒出一部分樣液于10 ml離心管，離心5 min（3 500 r/min）。準確移取1 ml上清液于10 ml容量瓶，用水定容至刻度，待上柱凈化。

1.3.2 固相萃取條件的選擇。試驗選用C18小柱做除雜的凈化處理。分別依次用純甲醇（1 ml/次）、超純水（3 ml/次）淋洗柱子，各3次，活化SPE小柱。移取5 ml稀釋樣液上柱，分別用5%、10%甲醇洗滌2次（3 ml/次），用刻度離心管收集濾出液，70 ℃氮吹，加1 ml 60%甲醇溶解，過膜待測。

另選用50%、60%甲醇洗滌2次（3 ml/次），再用純甲醇沖洗，用刻度離心管收集純甲醇濾出液，70 ℃氮吹，加1 ml 60%甲醇溶解，過膜待測。

1.3.3色譜條件。采用月旭C18反相色譜柱（4.6 mm×250.0 mm，5.0 μm），流動相為0.2%甲酸和乙腈，采用梯度洗脫，流速1.2 ml/min，洗脫程序見表1。柱溫為40 ℃，紫外檢測波長260 nm，進樣量10 μl。

2 結(jié)果與分析

2.1色譜條件的選擇為很好地分離大豆甙和染料木甙、大豆甙元和染料木素，采用梯度洗脫程序。在洗脫條件的探索中，乙腈起始濃度分別選擇了10%、15%、18%、20% 4個濃度。試驗發(fā)現(xiàn)，起始乙腈濃度越低大豆甙和染料木甙分離效果越好，當(dāng)起始乙腈濃度為10%時，大豆甙和染料木甙能達到良好的基線分離，且峰形尖銳。在分離大豆甙元和染料木素時，分別選擇了乙腈漸變最大濃度為40%、45%、55%、60% 4個濃度，在乙腈濃度最大為45%時，樣品中大豆甙元和染料木素既能達到很好的基線分離，又不會過長地延遲分析時間。

2.2標(biāo)準曲線的配制分別移取母液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml，用50%的色譜純甲醇定容至25 ml。按“1.3.3”色譜條件進樣測定，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，進行線性回歸，回歸方程及線性范圍見表2。

2.3精密度試驗取同一對照品溶液，按“1.3.3”色譜條件平行進樣5次，測定4 種大豆異黃酮含量，得大豆甙、染料木甙、大豆甙元、染料木素的RSD分別為0.65%、0.51%、0.81%、0.56%，說明儀器精密度好。

2.4重復(fù)性試驗稱取同一豆豉樣品，加入同一濃度的標(biāo)準溶液，按“1.3.1”和“1.3.2”樣品處理方法做5份平行樣品溶液，按“1.3.3”色譜條件進樣，測定4 種大豆異黃酮含量，得大豆甙、染料木甙、大豆甙元、染料木素的RSD分別為1.89%、2.13%、1.25%、0.96%，說明方法重復(fù)性好。

2.5穩(wěn)定性試驗取“2.4”重復(fù)性測試樣品溶液1份，每隔3 h進一次樣，測定峰面積，共測定6次，計算大豆甙、染料木甙、大豆甙元、染料木素的RSD分別為1.35%、1.78%、0.88%、0.79%，說明該方法制備的溶液在18 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6檢出限該試驗以空白試劑的3倍基線噪音（峰高）所對應(yīng)的待測組分的濃度為檢出限，計算得出大豆甙、染料木甙、大豆甙元、染料木素的檢出限分別是3.1×10-8、2.9×10-8、3.5×10-7、3.7×10-7 g/ml。

2.7固相萃取的結(jié)果在固相萃取試驗中，分別依次選用6 ml 5%、10%甲醇溶液洗脫，測定各洗脫液中大豆甙、染料木甙、大豆甙元、染料木素含量，試驗結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，5%甲醇洗脫液未有大豆異黃酮洗出，10%的甲醇洗脫液中含有大豆甙、染料木甙。因此，選用5%甲醇洗脫液洗脫水溶性雜質(zhì)。

2.9發(fā)酵豆制品與豆制品原料的測定結(jié)果對比 選用8種經(jīng)乳酸、霉菌發(fā)酵的豆制品及其豆原料依據(jù)該試驗的方法進行測定，結(jié)果見表4。可以看出，黃豆原料經(jīng)發(fā)酵后，糖甙類物質(zhì)基本轉(zhuǎn)化為甙元，發(fā)酵豆制品中甙元物質(zhì)豐富，對人體有很好的保健作用。

3 討論

發(fā)酵豆制品經(jīng)微生物降解后，雜質(zhì)多，在色譜柱上不易完全分離，且對色譜柱損耗大。該試驗選用固相萃取，能很好地除去樣品中的雜峰，使樣品中目標(biāo)成分能很好地分離，同時降低液相色譜柱的使用損耗。該試驗采用梯度洗脫同時測定4種大豆異黃酮，能很好地分離大豆甙與甙元，為準確測定4種大豆異黃酮提供了檢測依據(jù)。

通過對發(fā)酵豆制品在發(fā)酵前后的對比測定表明，豆制品經(jīng)發(fā)酵后，糖甙類物質(zhì)能很好地轉(zhuǎn)化為甙元，更容易被人體吸收，是一類很好的保健食品。

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