結核病實驗室診斷新技術的臨床應用

王心靜，王仲元

結核病實驗室診斷新技術的臨床應用

王心靜，王仲元

結核分枝桿菌全基因組測序的完成，使得對結核分枝桿菌的認識進入分子水平，分子生物學和免疫學的發展為診斷新方法提供了技術平臺，結核病實驗室診斷技術得到快速發展。為幫助臨床醫生了解現有新技術，以便更好地應用，本文系統介紹現有結核病實驗室診斷新技術的原理和臨床應用特點。

結核分枝桿菌；基因擴增；診斷

結核病是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）感染造成的慢性傳染病，1993年WHO宣布全球結核病控制處于緊急狀態[1]，2006年提出全球結核病控制目標是到2015年結核病患病率和病死率較1990年降低一半[2]。2013年報告新發結核病例數減少，但患病率下降緩慢，耐多藥結核病（multidrug-resistant tuberculosis,MDR-TB）的診治遠未達到目標[3]。結核病控制效果不佳原因很多，AIDS、糖尿病和自體免疫性疾病等影響機體免疫功能的疾病發病率上升，以及耐多藥Mtb尤其是廣泛耐藥Mtb感染率上升是重要因素；另一個十分重要的原因是結核病傳統的抗酸桿菌涂片及培養等技術靈敏度低、耗時長，造成結核病的診斷延遲或誤診。

在WHO的推動下，結核病的實驗室診斷技術時效性和準確率上得到了顯著提高。為幫助臨床醫生了解結核病檢測技術，以便更好地應用，本文系統介紹現有結核病實驗室診斷新技術的原理和應用。

1 核酸擴增技術（nucleic acid am plification tests, NAAT）

Mtb H37Rv株的全基因組測序工作的完成，使得人們能夠從基因水平上認識Mtb[4]。近些年，針對Mtb耐藥和遺傳變異等相關基因的序列和功能的研究取得了突破性進展，如發現分枝桿菌特異性保守序列IS6110、16S rRNA基因、hsp65基因和rpoB基因等[5]，為開發新的診斷技術提供了理論基礎。

NAAT的快速性和高靈敏度是其用于結核病實驗室診斷的最大優勢。近幾年NAAT的快速發展為結核病診斷提供了技術基礎，Mtb核酸檢測也成為結核病實驗室診斷技術發展的最大亮點。

1.1 技術原理及相應產品

1.1.1 實時熒光定量PCR此技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它具有特異性更強、可有效解決PCR污染問題以及自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應用[6]。熒光定量PCR技術有以下2個需要了解的概念。Ct值：C代表Cycle，t代表threshold（閾值，臨界值）。Ct值的含義是每個反應管內的熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環數。每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小。熔解曲線：PCR擴增反應完成后，逐漸升高溫度，隨著反應中雙鏈DNA變性，熒光染料又回復到游離狀態導致熒光信號降低。用熒光信號改變的負一次導數與溫度作圖，形成熔解曲線，不同產物有自己的特征峰（熔解溫度，即DNA雙鏈解鏈50%的溫度），用這個特征峰可將特異性產物與其他產物區分開。

目前，臨床開展的Mtb核酸檢測多數是使用實時熒光定量PCR技術[7]，根據Ct值判斷樣本中是否存在Mtb特有DNA片斷，敏感性良好。但是由于死亡的Mtb DNA也能夠被檢測到，所以不能作為病情追蹤。

根據熔解曲線與標準曲線的對照，能夠準確區分野生型、雜合突變型和純和突變型基因。此法不受突變位點和類型的局限，無需序列特異性探針，但不能測出基因突變的具體位置和類型。臨床上已有應用此技術檢測Mtb耐藥的試劑盒[8-9]。

1.1.2 RNA恒溫擴增實時檢測（simultaneousamplification and testing,SAT）該技術是將新一代核酸恒溫擴增技術和實時熒光檢測技術相結合的一種新型核酸檢測技術。在同一溫度下，首先通過M-MLV反轉錄酶產生靶標核酸RNA的1個雙鏈DNA拷貝，然后利用T7RNA多聚酶從該DNA拷貝上產生多個RNA拷貝，每個RNA拷貝再從反轉錄開始進入下一個擴增循環；同時，帶有熒光標記的探針和這些RNA拷貝特異結合，產生熒光。此實驗檢測的底物是RNA，其擴增效率、靈敏度和特異度高，反應時間短，操作簡單，同時RNA容易降解，可減少污染。

將SAT技術應用于Mtb檢測是國內自主專利技術[10]。因為只有活菌才有陽性檢測結果，因此與DNA檢測相比，此檢測結果可作為區分死菌和活菌的依據，有利于用藥后的療效監測。

1.1.3 環介導等溫擴增法（loopmediated isothermal amplification,LAMP）該技術于2000年由日本榮研公司開發，利用鏈置換型DNA聚合酶在恒溫下進行擴增反應，產生大量的擴增產物即焦磷酸鎂白色沉淀，通過肉眼觀察白色沉淀的有無判斷靶基因是否存在，是一種適合現場和基層進行快速檢測的方法。

應用LAMP定性檢測臨床標本中的Mtb DNA無需擴增儀，肉眼就能觀察結果，整個過程只需要1h。2011年WHO專家組認為LAMP是一項潛在的快速診斷結核病的技術。但是與痰涂片鏡檢相比，其特異性是個問題，較高的成本可能會制約臨床應用[11]。

1.1.4 基因芯片技術基因芯片又稱DNA芯片（DNA chip）或DNA微陣列（DNAmicroarray），是將大量特定序列的探針分子密集、有序地固定于經過處理的載體上，加入標記的待測樣品，進行多元雜交，通過雜交信號的強弱及分布，用特殊儀器來分析目的分子的有無，從而獲得樣品的遺傳信息。基因芯片能夠進行高通量篩選及檢測分析，解決了傳統核酸印記雜交技術操作復雜、檢測目的分子數量少等不足。

臨床上應用我國有自主知識產權的Mtb耐藥檢測芯片及非Mtb菌種鑒定芯片，耐藥芯片可同時檢測利福平和異煙肼的耐藥情況，非Mtb菌種鑒定芯片可鑒定常見的17種非Mtb。這2種芯片檢測均可在6 h內完成，但結果與樣本中菌量有一定的相關性，菌量過少或操作失誤容易出現無效檢測結果。

1.1.5 分子線性探針技術（line probe assay,LPA）此技術基于多重PCR原理，將PCR擴增、反向雜交和膜顯色技術合為一體。首先通過使用引物擴增目的片斷，擴增產物后與膜上已固定的特異性探針雜交，雜交物通過生物素標記的酶發生顯色反應，由此判斷靶DNA特定基因的堿基突變。

GenoType MtbDR是德國Hain Lifescience的產品，利用LPA檢測是否存在Mtb DNA，同時檢測Mtb耐利福平和異煙肼基因來診斷MDR-TB，在2008年得到WHO的認可[12]。推薦LPA用于涂片陽性的痰標本和培養物中，以快速檢測利福平和異煙肼耐藥，但不推薦用于二線抗結核藥耐藥性檢測。此技術耗時約8 h，反應相對容易被污染，對技術水平要求較高。

1.1.6 自動化核酸擴增Xpert Mtb/RIF由美國Cepheid公司研發，是一項全自動分子診斷方法，集痰標本處理、DNA提取、核酸擴增、Mtb特異核酸檢測和利福平耐藥基因檢測于一體，是一種半巢式實時熒光定量PCR體外診斷技術，只需2 h即可同時實現Mtb定性和利福平耐藥的檢測。整個過程在封閉的腔室內自動化完成，可在普通實驗室條件下進行。2010年12月，該技術被WHO譽為突破性結核病診斷方法而向全球推薦[13]。2013年5月，WHO推薦對結核病疑似患者首先使用Xpert Mtb/RIF檢驗，尤其是疑似MDR-TB患者和合并HIV感染者，并建議在MDR-TB或HIV感染率低的地區，Xpert Mtb/RIF可用于涂片陰性病例的進一步檢測[14]。

1.2 臨床應用效率以上結核分子診斷產品部分已應用于各國臨床檢驗，因此應用效率研究報告比較豐富，WHO亦對其推薦的產品做了詳細的報告分析。比較分析這些報告的樣本均是臨床患者痰標本，考慮到每份痰標本的異質性，培養和核酸檢測如果不是來自同一份痰標本，可能會有不同的結果。它們的比較標準均是培養陽性，其中部分是羅氏固體培養陽性，部分是液體培養陽性，而液體培養靈敏度比固體培養高。另外，檢測場所的級別不同造成環境條件和使用人員的技術水平差別，這些因素都將影響最后的結果，因此試驗結論不盡相同。但基本共識是結核分子診斷產品所需時間少、診斷特異性高，可提高對涂片陰性患者的診斷靈敏度。表1～2為不同分子檢測的靈敏度和特異度。

應用于Mtb檢測的核酸擴增方法檢測快速、準確率高、便捷，優點很突出。但是臨床標本成分復雜，可能存在PCR反應的抑制因素，如某些血痰或干酪樣痰可能由于蛋白成分過高而造成檢測假陰性，這在臨床檢測中并不少見。耐藥基因的存在不是惟一的耐藥機制，Mtb katG和inhA基因突變占異煙肼耐藥菌株約80%，即使是靈敏度最高的耐利福平基因rpoB突變，也只能發現約95%的耐藥菌，臨床應用時會發現耐藥表型和基因型不一致[21-22]。所以，核酸擴增方法還不能完全代替傳統的抗酸桿菌涂片和培養方法。另外，目前國內核酸擴增方法的收費、試劑或儀器價格比較高，在很大程度上影響了臨床應用。

表2 不同核酸擴增方法診斷M tb耐藥的靈敏度和特異度Table 2 Sensitivity and specificity of different diagnostic assays for detecting drug-resistant M tb

2 免疫學診斷

2.1 Mtb干擾素釋放試驗Mtb核酸的RD-1區是卡介苗和大部分非Mtb缺失的部分，RD-1區表達的蛋白ESAT-6和CFP-10是Mtb特異的分泌蛋白，免疫原性強，被用作Mtb的特異性刺激原。多種Mtb特異性反應性因子如腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-2和干擾素γ誘導蛋白-10等被用做Mtb感染的潛在診斷指標[23-25]。其中干擾素γ釋放試驗（interferon-gamma release assay,IGRA）已被WHO宣布為Mtb潛伏感染的診斷試驗，此試驗有ELISA方法和ELISpot方法，這2種方法診斷潛伏感染效能無差別，用于診斷結核病時，ELISpot方法靈敏度更高，但也有研究認為差異無統計學意義[26-27]。

近幾年對干擾素釋放試驗在結核病診斷中的意義有較多研究，有研究顯示在結核病的治療過程中干擾素水平下降；也有截然相反的研究結果，即治療過程中干擾素水平上升，還有研究發現治療2個月后干擾素的下降水平與復發的可能性相關[28-29]。目前多數研究認為干擾素釋放試驗不適于評價治療反應[30]。2011年10月WHO發表專家報告，指出IGRA不能準確預測潛伏感染發展至活動性結核病的風險，不應作為活動性結核病的診斷指標[31]。干擾素釋放試驗在結核病和結核感染診斷上是否優于結核菌素試驗還有爭議，基本達成共識的是對卡介苗接種人群和非Mtb感染高發人群，干擾素釋放試驗的特異度顯著高于結核菌素試驗[30]。因此，對于結核病高發區，干擾素釋放試驗的意義更在于其對陰性的排除診斷價值[32-33]。但要注意此試驗的假陰性，尤其對于伴發其他免疫性或血液疾病的患者以及應用糖皮質激素治療超過1周的患者，陰性結果不能排除診斷。

2.2 結核抗體檢測結核抗體檢測已歷時多年，現有的抗體檢測主要是針對Mtb LAM、38kD和16kD抗原，已有報道的靈敏度和特異度比較差異較大。WHO明確提出現有結核抗體試驗不能作為結核病和結核感染的診斷依據，希望新的具有診斷效能的抗原被發現，而試圖發現新的具有高診斷效能因子的腳步從未停歇[34]。

3 結語

分子生物學和免疫學的發展為結核病診斷技術的突破提供了可能，目前新出現的核酸擴增方法和免疫學方法在診斷效能上確有提高，但由于其自身的限制和Mtb的特點，這些方法依舊不能替代傳統的Mtb涂片和培養方法，臨床應用時應清楚每一種診斷方法的意義和局限性，以利于臨床診斷和治療。

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（2014-07-29收稿 2014-08-15修回）

（責任編委 王永怡 本文編輯 陳玉琪）

Clinical application of the new laboratory diagnostic techniques of tuberculosis

WANG Xin-jing,WANG Zhong-yuan
Clinical Laboratory Department,Institute of Tuberculosis,309 Hospital of PLA,Beijing 100091,China

As whole-genome sequencing of Mycobacterium tuberculosis(Mtb)makes it possible to understand Mtb at the molecular level,and the development ofmolecular biology and immunology provides a technology platform for the new diagnostic assays,there has been a rapid development in novel diagnostic assays designed to detect Mtb and its drug resistance.To help clinicians understand the existing novel assays for better application,the authors introduce the principles and features of the existing novel diagnostic techniques of tuberculosis.

Mycobacterium tuberculosis;gene amplification;diagnosis

R378.911

A

1007-8134(2014)06-0373-04

國家自然科學基金（81071319）

100091北京，解放軍第三〇九醫院結核病研究所臨床實驗室（王心靜），全軍結核病研究所（王仲元）