反相高效液相色譜法測定護肝膠囊中葛根素含量

李曉娟

（安徽省安慶市立醫院，安徽 安慶 246003）

護肝膠囊具有疏肝理氣、健脾消食的功效，可降低轉氨酶，用 于治療脂肪肝、酒精肝、藥物性肝損傷、慢性肝炎及早期肝硬化等。同時，具有解酒、調脂、解毒、抗炎等效果[1]，是臨床用于解酒、保肝臟的一味良藥。其由葛根、金銀花、柴胡、茵陳等6味中藥組方，經粉碎過100目篩后，分裝成膠囊，葛根在方中起到重要作用。本試驗中建立了反相高效液相色譜（RP－HPLC）法，并用于測定護肝膠囊中葛根素的含量，以控制產品質量。現報道如下。

1 儀器與試藥

日本島津LC－20AT型高效液相色譜儀，包括SPD－20A檢測器，CT－20型柱溫箱；上海必能信CQ－80型超聲波清洗器；AB265－S型電子天平（瑞士梅特勒公司）。葛根素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110752－200511）；甲醇為色譜醇，純化水；護肝膠囊（宜寧藥業股份有限公司，批號為 130321，130612，131102，130715，市售品）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：KromasilC18柱（250mm ×4.6mm，5μm，日本島津公司）；流動相：水－甲醇（92 ∶8）；檢測波長：245 nm；流速：1.0 mL /min；柱溫：35 ℃ ；進樣量：20 μL。

2.2 溶液制備

稱取葛根素對照品 11.2 mg，精密稱定，干燥 12 h，置 10 mL容量瓶中，加50%的乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL中含葛根素1.12 mg的溶液，作為貯備液；精密量取貯備液1 mL，置10 mL容量瓶中，加50%的乙醇制成每1 mL約含葛根素0.112 mg的溶液，作為對照品溶液。取護肝膠囊20粒內容物，取內容物細粉約0.1 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加入50%的乙醇25 mL，50℃超聲處理30 min，放冷至室溫，以50%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液，續濾液經 0.45 μm的微孔濾膜過濾，即得供試品溶液[6－7]。按處方組成比例，稱取除葛根的方中其他藥材適量，與供試品溶液制備方法同法制備溶液，作為陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

系統適用性試驗：精密吸取 2.2項下 3種溶液各 10 μL，按擬訂的色譜條件進樣測定。色譜圖見圖1。

線性關系考察：精密吸取葛根素對照品溶液（質量濃度為0.112 g /L）1，2，5，10，15，20 μL，分別注入液相色譜儀，按 2.1 項下色譜條件測定，以葛根素質量濃度為橫坐標、峰面積積分值為縱坐標繪制標準曲線，回歸方程為 A＝6.91×105C ＋2.13×105，r＝0.999 7（n＝6）。結果表明，葛根素進樣質量濃度在 0.112 ～2.24 g/L范圍內與峰面積積分值具有良好的線性關系。

精密度試驗：精密吸取同一葛根素對照品溶液（質量濃度為 0.112 g /L）10 μL，重復進樣 6 次。結果峰面積積分值分別為5 682 219，5 622 176，5 671 835，5 712 194，5 666 457，5 622 364，RSD ＝0.81%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批號的樣品（批號為130321）5份，依法制備供試品溶液并測定含量。結果的 RSD為 0.79%（n＝5），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，分別于制備后 0，2，4，6，8，10 h時進樣測定 1次，進樣量 10 μL。結果峰面積積分值的RSD＝0.88%（n＝6），表明供試品溶液在10 h內基本穩定。

加樣回收試驗：稱取已知葛根素含量的樣品（批號為130321）0.05 g，共 6份，精密稱定，分別精密加入對照品貯備溶液 0.5，0.5，1.0，1.0，1.5，1.5 mL，依照 2.2 項下供試品溶液制備方法制備溶液并依法測定含量，計算回收率。結果見表1。

圖1 高效液相色譜圖

表1 葛根素加樣回收試驗結果（n＝6）

2.4 樣品含量測定

按擬訂的含量測定方法測定4批樣品中葛根素的含量，結果見表2。

3 討論

中藥制劑中葛根素的含量測定方法很多[6－7，10，12]，對該類中藥制劑提取方法的選擇，關系到藥品主要成分的提取。以葛根素含量為考察指標，對提取溶劑進行考察，分別以甲醇、20%甲醇、50%甲醇、80%甲醇、50%的乙醇溶液25 mL為溶劑超聲30 min，結果表明，50%乙醇為提取溶劑時提取的含量較高，故選其為樣品的提取溶劑。同時，對樣品提取方式、溫度及時間進行了考察，結果顯示回流和超聲提取對含量的影響不大，且超聲操作較簡便，時間以30 min為宜，能將葛根素提取完全，故選用50℃超聲提取30 min作為提取方法。

試驗過程中，對比不同流動相的分離效果，如以不同比例的甲醇－水、乙腈－水、0.05%磷酸溶液－乙腈－甲醇等流動相系統，結果表明，以流動相為水－甲醇（92∶8）時能將葛根素與雜質峰較好地分離，且方中其他成分對葛根素的含量測定無干擾。

生產中，由于中藥制劑的原料可能來自不同的產地，因此采用不同產地的葛根為原材料進行對比檢測，根據測定的平均結果，綜合考慮到藥材的產地、采收、加工等因素[8－9，11]，護肝膠囊每粒含葛根以葛根素（C21H20O9）計不得少于 3.5 mg。總之，本試驗中所建立的含量測定方法不僅操作簡單、準確，且重復性好，可用于護肝膠囊的質量控制。

表2 樣品含量測定結果

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