生精膠囊微生物限度檢查方法驗證

公 偉，楊 玲

（浙江省紹興市食品藥品檢驗所，浙江 紹興 312071）

生精膠囊可補腎益精、滋陰壯陽，用于腎陽不足所致腰膝酸軟、頭暈耳鳴、神疲乏力，男性不育癥，男子無精、少精、弱精、精液不液化等癥[1]。該藥主要成分為鹿茸、枸杞子、人參、冬蟲夏草、菟絲子、沙苑子、淫羊藿、黃精、金櫻子、覆盆子、大血藤等19味中藥[2]。根據其用途、成分和制法，按照2010年版《中國藥典(一部)》微生物限度檢查法的要求，該藥應進行細菌數、霉菌和酵母菌數測定，控制菌應進行大腸埃希菌、大腸菌群和沙門菌檢查。筆者對該藥進行了微生物限度檢查方法的驗證，現報道如下。

1 材料與菌株

生精膠囊（規格為每粒 0.4 g，批號為 20100701，20100702，20100703，施強藥業集團有限公司）。營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、膽鹽乳糖培養基（BL）、乳糖膽鹽發酵培養基、營養肉湯培養基、4－甲基傘形酮葡萄糖苷酸培養基（MUG）、四六磺酸鈉亮綠基礎培養基（TTB）、單眼流入瓊脂培養基（DHL）、曙紅亞甲基藍瓊脂培養基（EMB）、改良馬丁培養基、改良馬丁瓊脂培養基，均由北京三藥科技開發公司生產；pH＝7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液（杭州微生物試劑有限公司）；大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102]、 金 黃 色 葡 萄 球 菌 （Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501]、白色假絲酵母菌（ Candida albicans）[CMCC(F)98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003]、乙型副傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B）[CMCC(B)50094]。

2 方法與結果

2.1 菌液制備

大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及乙型副傷寒沙門菌取經35℃培養24 h的營養肉湯培養物；白色假絲酵母菌取經25℃培養48 h的改良馬丁培養物；黑曲霉取經25℃培養7 d的改良馬丁瓊脂培養物，加入含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液5 mL，洗下孢子至無菌試管中。以上菌懸液用0.9%無菌氯化鈉溶液按10倍遞增稀釋法，稀釋至菌數為50～100 cfu/mL備用。

2.2 供試液制備

取供試品10 g，加入pH＝7.0的無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100 mL，充分振搖混勻，作為1∶10的供試液。

2.3 預試驗

按2010年《中國藥典（一部）》附錄ⅩⅢC“微生物限度檢查法”中常規法檢驗，金黃色葡萄球菌的回收率為30%（應不低于70%），表明本品具有抑菌作用。

2.4 回收率試驗

2.4.1 培養基稀釋法

供試品對照組：取1∶10的供試液1 mL，平行注入5個平皿中，每個平皿約0.2 mL，于 35℃培養 3 d，測定供試品本底細菌數；試驗組：取1∶10的供試液1 mL，平行注入 5個平皿中，每個平皿約0.2 mL，再取上述菌液1ml分別注入以上5個平皿中，每個平皿約0.2 ml，立即傾注營養瓊脂培養基，待凝固后，置規定溫度培養3 d后觀察結果；菌液組：分別取上述制備的菌液1 mL采用平皿計數法，測定菌液中每毫升的活菌數；稀釋劑對照組：取pH＝7.0的無菌氯化鈉 －蛋白胨緩沖液90 mL，加入菌液10 mL，使最終菌濃度為含50～100 cfu/mL，按供試液制備方法處理，測定菌數，計算回收率。結果見表1。

2.4.2 常規法

供試品對照組：取1∶10供試液1 mL，注入平皿中，于25℃培養5 d，測定供試品本底的霉菌和酵母菌數；試驗組：取1∶10供試液1 mL和上述菌液1 mL，注入平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，待凝固后，置規定溫度培養5 d后觀察結果，菌液組同 2.4.1。計算回收率結果見表 1。

2.5 控制菌檢查方法驗證

2.5.1 試驗組

大腸埃希菌：取1∶10供試液10 mL及10～100 cfu/mL大腸埃希菌菌液加至膽鹽乳糖培養基100 mL中，35℃培養18～24 h，取上述增菌液0.2 mL，加至MUG培養基5 mL試管中，35℃培養5～24 h，在366 nm波長處下觀察，同時用未接種的MUG培養基作本底對照，觀察后，沿管壁加入數滴靛基質試液，觀察顏色變化。結果見表2。

大腸菌群：取1∶10供試液、1∶100供試液、1∶1 000供試液各1 mL及10～100 cfu/mL大腸埃希菌菌液加至乳糖膽鹽發酵培養基10 mL中，作為試驗組。35℃培養18～24 h，觀察是否產酸產氣。結果見表2。

沙門菌：取取供試品10 g加至200 mL營養肉湯培養基中，加入10～100 cfu/mL乙型傷寒沙門氏菌菌液1 mL，用磁力攪拌器攪拌，使膠囊完全融化，作為試驗組。35℃培養18～24 h，取此培養物 1 mL，接種至 10 mL TTB培養基中，35℃培養 18～24 h，取上述增菌液分別劃線接種于DHL和EMB培養基平板上，35℃培養18～24 h，觀察結果。結果見表2。

2.5.2 陰性對照組

取相應的稀釋液代替供試液，不加試驗菌，操作同試驗組，結果見表2。

2.5.3 陽性試驗組

取相應的試驗菌液1 mL，不加供試液，操作同試驗組。結果見表 2。

表1 3批供試品菌落數及回收率試驗結果

表2 控制菌（大腸埃希菌、沙門菌）檢查結果

3 討論

生精膠囊為多種生藥原粉的混合粉末，根據預試驗，如果采用常規法，金黃色葡萄球菌回收率小于70%。經查文獻[3]，黃精、金櫻子、覆盆子、大血藤等均對金黃色葡萄球菌有抑制作用。試驗結果顯示，采用培養基稀釋法（0.2 mL/皿）可以消除金黃色葡萄球菌的抑制作用，回收率大于70%。按2010年《中國藥典(二部)》[4]，經回收率試驗和控制菌檢查方法驗證，細菌計數采用培養基稀釋法，霉菌及酵母菌計數和控制菌檢查采用常規法，符合2010年《中國藥典(一部)》微生物限度檢查法的基本要求。本驗證方法可作為生精膠囊的微生物限度檢查方法。

參考文獻：

[1]張小琴，彭金蘭.生精膠囊治療男性不育癥Meta分析[J].中國藥師，2013，16（8）：1 208－1 212.

[2]WS－11457(ZD－1457)－2002.國家中成藥標準匯編·中成藥地方標準上升國家標準部分(內科腎系分冊)[S].

[3]高學敏.中藥學(供中醫藥專業用)[M].北京：中國中醫藥出版社，2002：110.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：107－116.