結腸腺瘤性息肉病基因蛋白在二甲肼誘導大鼠大腸癌過程中的表達*

馬曉強，王偉杰，李 海

（寧夏醫科大學總醫院結直腸外科，寧夏 銀川 750004）

結腸腺瘤性息肉病基因（APC）是一種抑癌基因，能調節細胞 生長和自身穩定[1]。目前，許多研究已經證實，Wnt信號轉導途徑失調是人類大腸癌的發生中的早期事件，其中APC蛋白在Wnt信號通路中起關鍵的抑制作用?？梢哉f，APC蛋白是一個分子“守門人”，尤其在腺瘤發生發展進程中。由于基因產物的改變，往往始于APC的突變，且相應的突變在惡性腫瘤中穩定存在，從而造成腫瘤的發生和細胞的無序分裂[2]。因此，通過動態觀察APC蛋白，了解其表達情況，能加深對APC蛋白及其與大腸癌演變過程之間相互關系的認識，從而實現大腸癌的早發現、早診斷和早治療，具有重要的現實意義。

1 材料與方法

1.1 動物與試藥

SD大鼠60只，雄性，6～8周齡，體重200～250 g，由寧夏醫科大學實驗動物中心提供，合格證編號為SCXK＜寧＞2005－0001。普通飼料(北京科澳飼料公司)。二甲肼（DMH，日本東京化成工業株式會社）。

1.2 方法

動物模型的建立和分組：將60只SD大鼠隨機分為模型組40只，正常對照組（C組）20只。兩組大鼠采用標準同型普通飼料喂養，自由飲水，光照時間為12 h，室溫25℃，相對濕度50%環境下分籠飼養，每籠 4只。將二甲肼（DMH）溶于 0.001 mol/L的 EDTA溶液，配成 8 g/L的 DMH溶液，備用。模型組大鼠皮下注射 DMH溶液，每周1次（20 mg/kg）；對照組皮下注射與模型組DMH等體積的生理鹽水，每周1次，兩組同時維持給藥25周。分別于第 15周和25周[即大腸腺瘤組（A組）和大腸癌組（B組）]時處死大鼠，兩組各20只，收集大腸組織標本。將其中的一部分大腸組織標本放入－80℃冰箱中，擬行免疫蛋白印跡檢測；將剩下的大腸組織標本以甲醛固定，石蠟包埋，進行免疫組化染色。

1.2.1 免疫組織化學檢測

將大鼠大腸癌組織石蠟切片、脫蠟和水化后，以磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗 3次（每次 2～3 min），對組織抗原進行相應的修復。每張切片加3%過氧化氫50 μL阻斷，溶液室溫放置10 min，再用 PBS沖洗 3次（每次 2～3 min），移去 PBS液。滴加濃度為1∶100的兔抗鼠APC多克隆抗體，4℃條件下放置過夜。然后以 PBS沖洗 3次，每次3 min，移去 PBS液。在滴加聚合物輔助劑后室溫下孵育 20 min，用 PBS沖洗 3次，每次 3 min。移去PBS液，滴加辣根酶標記山羊抗兔/大鼠IgG多聚體，室溫下孵育 30 min，PBS沖洗 3次，每次 3 min。除去 PBS，每張切片加 2滴新鮮配制的 3，3－四鹽酸二氨基聯苯胺（DAB）液，顯微鏡下觀察 3～10 min。自來水沖洗，蘇木素復染，PBS沖洗返藍。DAB顯色，梯度酒精脫水，中性樹膠封固。免疫組化染色結果判定標準見表 1。兩項計分相乘之積在 0～5分之間記為“－”，5～12分記為“＋”。

表1 APC免疫組化染色判定標準

免疫蛋白印跡技術檢測：將去除脂肪組織和結締組織等非目的組織的固體組織樣本剪碎，勻漿，加入含有苯甲基磺酰氯（PMSF）的 RIPA裂解液500 μL裂解組織，提取總蛋白，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。制備10%分離膠和5%濃縮膠，每孔上樣50 μg進行 SDS－PAGE電泳。其中濃縮膠條件為80V 45 min，分離膠 110V 90 min；350 mA恒流電轉 130 min至PVDF膜。用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液4℃封閉過夜。分別加入兔抗大鼠 APC抗體（濃度為1∶200）、兔抗大鼠 β－actin抗體（1∶1 000）室溫孵育 2 h。TBST洗膜 3次，加入 HRP標記的山羊抗兔 IgG抗體(濃度1∶1 000)和HRP標記的山羊抗小鼠 IgG多抗(濃度 1∶1 000)室溫孵育 1 h。TBST洗膜 3次，加入 ECL化學發光試劑自顯影、曝光。用凝膠分析軟件對圖像進行分析。APC蛋白的相對表達量用APC蛋白灰度值/β－actin蛋白灰度值表示。

1.3 統計學處理

采用SPSS 11.5統計軟件。經凝膠分析軟件所得的相對強度以±s表示，組間均數比較采用 t檢驗。組間率的比較采用 χ2檢驗或四格表資料的Fisher確切概率法。假設檢驗的顯著性水準取 α ＝ 0.05。

2 結果

2.1 動物建模結果觀察

大鼠大腸組織HE染色后鏡下觀察發現，C組大鼠大腸組織無異常變化，組織彈性好，與周圍組織無黏連，腸腔少量正常糞粒。A組大鼠大腸組織可見數量不等的絨毛狀成分，同時表現為程度不一的上皮異型性增生，一般輕至中度。B組大鼠大腸組織根據來源和分化程度的不同在組織學上表現較為多樣，其中乳突狀腺癌表現為粗細不等的乳突狀結構，乳頭細長，癌細胞呈柱狀，可具有不同的分化程度；管狀腺癌由腺管狀結構組成；黏液腺癌則以大量黏液為特征或為囊腺癌結構，囊內充滿黏液等。

2.2 免疫組織化學法檢測APC蛋白的表達情況

結果見表2和圖1。APC染色陽性位置主要在大腸細胞的細胞漿中，細胞漿內可見棕黃色或黃色顆粒沉積，A組和B組大鼠組織中均未見有陽性表達；C組大腸細胞組織中陰性10例(50.00%)，陽性 10 例(50.00%)。組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。充分說明APC蛋白在正常大鼠大腸組織中的陽性表達率明顯高于在大腸腺瘤、大腸癌組織的陽性表達率。

表2 APC蛋白在大腸腺瘤、大腸癌與正常組織中的表達

圖1 3組大鼠APC蛋白的表達情況（免疫組化法）

2.3 免疫印跡法檢測APC蛋白的表達情況

結果見表3和圖2。正常大腸組織經Western－blot技術檢測后，均表現為包含有1條特異性條帶，其相對分子質量約為300×103，而該條帶在大腸腺瘤及大腸癌組織卻未曾發現。利用凝膠分析軟件進行半定量分析，分別得出 IOD值，并跟β－actin比較，顯示APC蛋白的表達在大腸腺瘤、大腸癌與正常組織中差異有統計學意義（P＜0.05），而在大腸腺瘤與大腸癌組中差異無統計學意義（P ＞0.05）。

表3 APC在大腸腺瘤與正常組織中的相對表達強度（±s）

表3 APC在大腸腺瘤與正常組織中的相對表達強度（±s）

與C組比較組別 I O D值P A組B組C組t值(A組比B組)P(A組比B組)0.0 2 8 ± 0.0 1 1 0.0 9 0 ± 0.3 1 4 0.8 2 3 ± 0.2 1 2－ 2 0.3 8 6 0.0 8 t值－ 1 8.3 8 6－ 1 3.3 8 6 0.0 0 1 0.0 0 0

圖2 3組大鼠APC蛋白的表達情況（免疫印跡法）

3 討論

大腸癌是常見的消化系統惡性腫瘤[3]，世界范圍的流行病學調查資料表明，在西方發達國家與癌癥相關的死亡原因中排第2位，嚴重威脅著人類生命健康。在我國，大腸癌的發病率呈逐年增高的態勢，發病率居第4位[4]。關于大腸癌的發生發展過程，有兩種學說：一是腺瘤－癌序列相關學說，即所謂傳統概念[5]；一是近年來發現的新生癌學說，它不經過腺瘤性息肉階段，直接由大腸黏膜發生癌變產生[6]。近年來，雖然在分子生物學水平和蛋白質組學方面對其機制的探討取得了較大進展，但對于大腸癌的組織發生情況一直存在著不同的觀點。鑒于實驗性腫瘤模型在研究癌癥原因、早期治療、疾病預防的重要作用，因此通過建立實驗性大腸癌動物模型，探討大腸癌形態的動態變化和進展方式，顯得尤為重要。本研究中對大鼠進行二甲肼皮下注射建立了大腸腺瘤－癌序列動物模型，并觀察了APC蛋白在大腸癌發病過程中的變化情況，以期發現新的治療靶點。

近年來的研究結果表明，多個抑癌基因的失活和癌基因的激活與大腸癌的發生、發展關系密切，牽涉到相關的組織形態學改變和進行性分子遺傳學改變，其中APC被認為是熱點基因[7]，與大腸腺癌發生關系密切。APC蛋白是由Herrera進行細胞遺傳學研究時發現的一個新的抑癌基因（1986年），在許多組織中幾乎都有表達，它不僅調節機體自身穩定，還可促進細胞生長[8]。Wnt的信號傳導通路離不開APC蛋白的參與，細胞特化、增殖、極性以及遷移的正常調節離不開Axin及Osk－3D與正常組織 APC蛋白的結合形成復合物[9]。截短的無活性的APC蛋白系APC基因突變所導致編碼的APC蛋白的改變，野生型APC蛋白產物不能正常地發揮生理功能，關鍵是截短APC蛋白與其結合所產生的一種負顯性作用，能導致細胞癌變的發生，大到細胞黏附和生長，小到細胞分化、增殖及凋亡調控和細胞內信號等全方位的改變[10]。通過不同組間大鼠大腸組織免疫組化分析發現，APC蛋白在正常對照組強陽性表達，而在大腸腺瘤組和大腸癌組中無表達。這表明在大腸癌發病過程中APC蛋白表達的抑制發揮了一定的作用。進一步分析發現，大腸腺瘤組和大腸癌組大鼠間APC蛋白的表達未見明顯差異，提示在大腸組織不典型增生至腫瘤發生過程中APC蛋白所起的作用不明顯。這也在一定程度上提示，在腫瘤發生和發展過程中，還有其他因素的參與，這一點在大鼠大腸組織免疫印跡分析中得到了證實。免疫印跡分析結果顯示，APC蛋白在正常對照組大鼠大腸組織中高表達，而在大腸腺瘤組和大腸癌組大鼠組織中則未見明顯表達。

綜上所述，APC蛋白在大鼠大腸癌的發病過程中可能起到了啟動作用，在后期疾病惡化過程中可能還有其他的因素參與。APC蛋白可望作為早期預防和檢測的靶點，而更多的大腸癌發病機制還有待今后進一步深入的研究。

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