高效液相色譜法測定人血清中伏立康唑的質(zhì)量濃度

張燕青，林雪玉，朱金平，費(fèi) 燕

（中國人民解放軍第一七五醫(yī)院·廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院藥學(xué)科，福建 漳州 363000）

伏立康唑（voriconazole，VRC）是第2代三唑類抗真菌藥物，具有抗真菌譜廣、生物利用度高、安全且可通過血腦屏障等特點(diǎn)，在真菌感染防治中發(fā)揮著重要作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)，伏立康唑的有效性和安全性與其血清質(zhì)量濃度密切相關(guān)[1－3]，有效質(zhì)量濃度范圍為 2 ～5μg/mL[3]，大于 6 μg/mL 時肝臟毒性的發(fā)生風(fēng)險顯著增加[4]。伏立康唑體內(nèi)代謝呈非線性藥物代謝動力學(xué)特征，血藥濃度在不同患者間差異較大，臨床可通過監(jiān)測其血藥濃度來提高臨床療效、減少不良反應(yīng)的發(fā)生。筆者采用高效液相色譜(HPLC)法測定人血清中伏立康唑濃度，方法簡單可靠、相關(guān)性好，可用于伏立康唑的血藥濃度常規(guī)檢測。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀(美國 Waters公司)，包括510泵，717自動進(jìn)樣器，996二極管陣列檢測器；Milli－Q純水器(美國Millipore公司)；XW－80A型旋渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)；電子分析天平(日本島津AEG－120型)；TGL－16M型臺式高速冷凍離心機(jī)(長沙英泰儀器有限公司)。伏立康唑?qū)φ掌?中國藥品生物制品檢定所，批號為100862－200701)；內(nèi)標(biāo)為硝西泮對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為 171217－200402)；乙腈、甲醇(Tedia公司，色譜純)，其他試劑均為分析純，水均為雙蒸水（本實驗室自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 血清來源

采集健康體檢者的靜脈血，低速離心后，取上層血清制備空白血清，備用。采集診斷為侵襲性真菌感染，并使用伏立康唑進(jìn)行治療且達(dá)到穩(wěn)態(tài)濃度的患者下次滴注伏立康唑前的靜脈血，低速離心后，取上層血清備用，作為患者血清樣品。

2.2 血藥濃度測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS 柱（200 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：25 mmol/L 磷酸二氫鉀緩沖液 －乙腈（32 ∶68）；流速：1.0 mL /min；柱溫：35 ℃；檢測波長：256 nm；進(jìn)樣量：50 μL。

2.2.2 溶液配制

精密稱取伏立康唑?qū)φ掌?0 mg，置25 mL的容量瓶中，用甲醇溶解至刻度，配成質(zhì)量濃度1 200 μg/mL的對照品貯備液，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩＞芊Q取25 mg硝西泮對照品，置25 mL的容量瓶中，用甲醇溶解至刻度，配成濃度1 000 μg/mL的對照品貯備液，將該貯備液用甲醇稀釋成25 μg/mL工作液，作為內(nèi)標(biāo)液，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 血清樣品處理

精密取血清樣品 200 μL于 1.5 mL Eppendorf管中，加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液，混勻后，加入乙腈 400 μL漩渦振蕩 2 min，13 000 r/min離心 10 min，取上清液 200 μL進(jìn)樣分析。

2.2.4 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備與檢測限確定：取空白血清200 μL，置1.5 mL Eppendorf管中，精密量取不同質(zhì)量濃度、相同體積的伏立康唑?qū)φ掌啡芤?10 μL，配成 0.3，0.6，1.0，1.5，3.0，6.0，12.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)血清樣品，再分別加入 10 μL內(nèi)標(biāo)液，按2.2.3項下方法處理，經(jīng)HPLC分析，記錄色譜圖，測得伏立康唑峰面積A1與內(nèi)標(biāo)峰面積 A2，計算峰面積比 A1/A2。以血清質(zhì)量濃度 C(mg/L)與峰面積比經(jīng)最小二乘法線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 Y＝0.377 X－0.063 5，r＝ 0.999 3(n ＝7)。結(jié)果表明，伏立康唑質(zhì)量濃度線性范圍為 0.3～12 μg/mL。當(dāng)信噪比(S/N)＝3 時，伏立康唑的最低檢測限可達(dá)到 0.3 μg/mL。

分離度與專屬性試驗：按擬訂色譜條件對空白血清、伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)品血清以及患者血清樣品進(jìn)行色譜分析，色譜圖見圖1。可見，伏立康唑與內(nèi)標(biāo)峰無明顯的內(nèi)生雜質(zhì)峰干擾，兩者的保留時間分別為 10.5 min 和 13.3 min。

圖1 伏立康唑高效液相色譜圖

準(zhǔn)確度試驗：取空白血清 200 μL，置 1.5 mL Eppendorf管中，配制成質(zhì)量濃度為 0.6，3.0，6.0 μg/mL 的血漿樣品各5份，按2.2.3項下方法處理，進(jìn)樣，記錄色譜圖，考察方法回收率。結(jié)果見表1。

表1 伏立康唑的方法回收率試驗結(jié)果(n＝5)

精密度試驗：取空白血清 200 μL，置 1.5 mL Eppendorf管中，配制成質(zhì)量濃度為 0.6，3.0，6.0 μg/mL 的血漿樣品各5份，按

2.2.3 項下方法處理，進(jìn)樣，記錄色譜圖，連續(xù) 4 d，測定日內(nèi)和日間精密度。結(jié)果見表2。

表2 伏立康唑的日內(nèi)、日間精密度試驗結(jié)果(n＝5)

穩(wěn)定性試驗:取空白血清 200 μL配制成質(zhì)量濃度為 0.6，3.0，6.0 μg/mL 的血清樣品各 3 份，室溫放置，分別于第 0，6，12 h按 2.2.3項下方法處理，進(jìn)樣。結(jié)果的 RSD分別為 6.06%，4.21%，4.68%，說明血清樣品在室溫放置12 h內(nèi)具有很好的穩(wěn)定性。配制質(zhì)量濃度為 0.6，3.0，6.0 μg/mL 的血清樣品，置－20 ℃冰箱中，于第 1，3，5，7，10，14 d，按 2.2.3 項下方法處理，測定。結(jié)果表明，血清樣品14 d內(nèi)穩(wěn)定性良好。配制質(zhì)量濃度為0.6，3.0，6.0 μg/mL的血清樣品各 3份，置 －20℃冰箱中，凍融 2次，凍融時間間隔 24 h，于凍融前、凍融后分別取樣 200 μL，按 2.2.3項下方法處理。結(jié)果顯示，凍融2次，質(zhì)量濃度無顯著性差異。

2.3 臨床應(yīng)用

采用本研究建立的方法為10例患者進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測，其中侵襲性肺部曲霉菌感染8例，骨髓炎（霉菌感染）2例；男7例，女 3 例；平均（42.8 ± 3.6）歲。測定的最大血藥濃度達(dá) 5.5 μg/mL，最小為 0.98 μg/mL，平均值為 2.72 μg/mL；其中在治療窗之內(nèi)4例，占 40.00%；低于治療窗5例，占50.00%;高于治療窗 1例，占 10.00% 。

3 討論

色譜條件的選擇:采用二極管陣列檢測器波長梯度方法，得到三維色譜光譜圖。三維立體圖顯示，伏立康唑在256 nm波長處有最大吸收。以256 nm進(jìn)行樣本檢測，出峰良好，出峰處無干擾，因而選擇256 nm作為檢測波長。試驗過程中，試用文獻(xiàn)[5－6]報道的氟康唑和酮康唑作為內(nèi)標(biāo)，發(fā)現(xiàn)在本實驗室條件下，其保留時間在3 min內(nèi)，不適宜作為內(nèi)標(biāo)。選用硝西泮作為內(nèi)標(biāo)，性質(zhì)穩(wěn)定，不干擾主峰，且保留時間合適；伏立康唑和硝西泮的保留時間分別為10.5 min和 13.3 min，且色譜峰不受內(nèi)源性雜質(zhì)干擾。由于伏立康唑的分子結(jié)構(gòu)中含有三唑環(huán)、吡啶環(huán)等堿性基團(tuán)，因此采用磷酸鹽緩沖液作為流動相，保持流動相pH穩(wěn)定，故選用磷酸鹽緩沖液/乙腈為流動相。

樣品處理方法的選擇：血清樣品的前處理一般采用固相萃取、液液萃取、高氯酸和三氟乙酸沉淀蛋白等方法，但考慮到固相萃取、液液萃取方法操作較復(fù)雜煩瑣，高氯酸和三氟乙酸可能會對伏立康唑和內(nèi)標(biāo)造成氧化破壞，故采用2倍乙腈直接沉淀蛋白，蛋白沉淀較完全。

監(jiān)測結(jié)果分析：臨床伏立康唑常用于治療和預(yù)防侵襲性真菌感染，常見的不良反應(yīng)有神經(jīng)功能障礙、視覺障礙、肝功能異常等[7－8]。文獻(xiàn)報道，當(dāng)伏立康唑血藥濃度大于 6 μg/mL 時，肝功能損傷的發(fā)生率將明顯增加，不良反應(yīng)發(fā)生率升高，而低于2 μg/mL時，治療效果不佳。伏立康唑主要通過肝臟細(xì)胞色素P450酶2C19代謝。CYP2C19基因是一個高度變異的多態(tài)基因，具有顯著種族差異，在亞洲人群中造成慢代謝表型最主要的突變基因為CYP2C19＊2和 CYP2C19＊3。研究發(fā)現(xiàn)，CYP2C19慢代謝型組伏立康唑的穩(wěn)態(tài)血藥濃度是快代謝型組的5倍。本試驗監(jiān)測的10例患者伏立康唑谷濃度個體差異大，1例谷濃度高于治療窗，5例谷濃度低于 2 μg/mL，4 例谷濃度在治療窗 2 ～5μg/mL 之內(nèi)。本試驗中建立的檢測人血清中伏立康唑質(zhì)量濃度的高效液相色譜法靈敏、簡單、專屬性高，分離完全，峰形良好，可用于伏立康唑的藥代動力學(xué)和血清藥物濃度監(jiān)測。

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