薄殼山核桃‘馬漢’雄蕊發育特性及花粉儲藏活力

楊先裕，黃堅欽，徐奎源，夏國華，袁紫倩，3，凌驊，王正加

（1.浙江農林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江臨安 311300；2.浙江省建德市林業局，浙江建德311600；3.浙江省杭州市林業科學研究院，浙江杭州 310016）

薄殼山核桃‘馬漢’雄蕊發育特性及花粉儲藏活力

楊先裕1，黃堅欽1，徐奎源2，夏國華1，袁紫倩1，3，凌驊1，王正加1

（1.浙江農林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江臨安 311300；2.浙江省建德市林業局，浙江建德311600；3.浙江省杭州市林業科學研究院，浙江杭州 310016）

為解決薄殼山核桃Carya illinoensis花期花粉的采集和有效保存等問題，系統觀測雄蕊開花習性，采用熒光染色反應（FCR）法研究了不同散粉期花粉生活力差異，以及不同儲藏條件（室溫密封、室溫密封干燥；4℃密封、4℃密封干燥；-70℃密封、-70℃密封干燥）和儲藏時間對花粉活力的影響。結果表明：①4月26日薄殼山核桃雄蕊花萼開裂，5月6日花藥由綠變黃，5月7-9日雄蕊進入散粉期，5月8日散粉量最大，占花粉總量的75%，至5月10日花粉基本散盡，花藥變黑、小花開始脫落；②散粉期花粉生活力大小依次為即將散粉期（花藥由綠變黃）＞散粉初期＞散粉盛期＞散粉末期，花粉耐儲藏性亦是即將散粉期最優，即將散粉期＞散粉初期＞散粉盛期＞散粉末期。③儲藏條件對花粉活力的保持有顯著影響，利于花粉生活力保持的儲藏條件依次為-70℃密封干燥＞-70℃密封＞4℃密封干燥＞4℃密封＞室溫密封干燥＞室溫密封；在任一儲藏條件下，花粉活力均隨儲藏時間而下降，干燥與不干燥差異不顯著。室溫下花粉活力下降最快，50 d后花粉已經完全喪失活力；4℃下花粉活力次之，120 d后花粉已經完全喪失活力；-70℃超低溫條件下保存效果最好，與常溫、低溫儲藏差異極顯著，儲藏360 d花粉還保持43.55%的活力。圖4表3參19

經濟林學；薄殼山核桃‘馬漢’；發育特性；花粉生活力；儲藏條件；熒光染料反應

薄殼山核桃Carya illinoensis是一種重要的木本油料樹種，又是珍貴的干果樹種［1］。中國的亞熱帶東部地區、長江流域和云南等10多個省均建立了薄殼山核桃引種區，并已建成種質資源庫、采穗圃、品種園和早實豐產示范林［2］。到目前為止，薄殼山核桃生產在國內仍未實現產業化，堅果消費大部分依賴進口，造成這種現象的一個重要原因是建園時未科學配置授粉樹，導致授粉不良，生理落果嚴重［3］。薄殼山核桃是典型的雌雄同株、雌雄異熟植物，在建園時需要注意品種搭配，選擇雌雄花期相匹配并且能夠相互親和的品種搭配種植，必要時在花期進行人工輔助授粉［4］。在生產中，薄殼山核桃散粉期，僅2～3 d，而雌花發育進程不一，且有等待授粉習性，短期內不能充分授粉，人工輔助授粉是一項重要的豐產措施［5］。所以花粉的采集和有效保存在生產中具有重要意義。薄殼山核桃‘馬漢’‘Mahan’品種是當前中國栽培最為廣泛的品種之一，也是常用的授粉品種。本研究以品種‘馬漢’為研究對象，通過研究不同散粉期花粉活力差異以及不同儲藏條件和儲藏時間對花粉活力影響的研究，找出最佳的花粉采集時間和最適儲藏條件，為人工輔助授粉提供最優保證。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗地位于浙江省建德市蓮花鎮齊平村薄殼山核桃早實豐產試驗林基地，29°34′42″N，119°18′21″E，海拔為110 m，年平均氣溫為16.0℃，年降水量1 818.8mm。供試材料為薄殼山核桃‘馬漢’品種12年生健康植株。散粉期花粉活力測定材料取即將散粉期（花藥由綠變黃）、散粉初期、散粉盛期、散粉末期雄花序散出花粉，不同儲藏條件花粉活力測定的花粉取自散粉盛期雄花序散出的花粉。

1.2 試驗方法

1.2.1 物候期觀察方法調查方法參考《經濟林研究法》《果樹研究法》中有關生物學調查部分和山核桃的一些性狀調查方法［6］。在基地挑選3株營養水平相近、長勢基本一致的植株作為標準株，取每植株東、南、西、北4個方向，每個方向選取10個結果枝進行掛牌，觀察記錄雄花芽萌動日期、雄花序生長日期、花萼開裂期、花藥由綠變黃、散粉初期（以25%小花花藥散開為標準）、散粉盛期（以50%以上小花花藥散開為標準）、散粉末期（以花藥完全開裂，花粉基本散盡，花序變黑褐色為標準）及小花脫落的變化過程。

1.2.2 花粉活力測定方法①花粉采集。采集即將散粉期、散粉初期、散粉盛期、散粉末期4個時期的雄花序。將各時期雄花序平攤在硫酸紙上，將已經散出的花粉收集，花序置避風陽光下晾曬，每隔半小時收集1次花粉。收集的花粉用100目篩子過篩去除雜質。②花粉保存。4個散粉時期花粉保存：常溫干燥保存，每天測花粉活力。不同儲藏條件下花粉保存：將薄殼山核桃散粉盛期的花粉隨機分成6份，裝入密封袋內，置于常溫密封、常溫密封干燥；4℃低溫密封和4℃低溫密封干燥；-70℃超低溫密封和-70℃超低溫密封干燥內（干燥條件即在密封袋內裝入500 g變色硅膠）。儲藏2，4，6，8，10，30，50，70，90，120，360 d后測各組的花粉活力。③花粉活力測定方法（FCR熒光染色法）［7-8］。a.配制母液1（SS1）：1.75 mol·L-1蔗糖，3.32 mmol·L-1硼酸，3.05 mmol·L-1硝酸鈣，3.33 mmol·L-1硫酸鎂，1.98 mmol·L-1硝酸鉀，蒸餾水定容后，置4℃低溫保存備用。另外，為了避免由滲透壓引起的花粉破裂，可以適當增加蔗糖濃度，還可以通過增加鹽的濃度增強熒光效果。b.配制母液2（SS2）：把雙乙酸熒光素溶于丙酮中，配成濃度為7.21 mmol·L-1后，置棕色玻璃瓶，4℃低溫保存備用。c.工作液：使用時，取8～12滴SS2于10mL SS1中，混勻直到混合液變為輕乳狀即為工作液。操作時，取2～3滴工作液滴于花粉上，蓋上蓋玻片，2min后置熒光顯微鏡下觀察。重復3次·處理-1，觀察5個視野·重復-1，統計每個視野內花粉顆粒總數（明場光照下）和被熒光染色花粉顆粒總數。④花粉活力計算方法：有生活力花粉百分數=（視野內變綠色花粉顆粒數目/視野內花粉顆?？倲担?00%。

1.2.3 數據處理方法試驗數據采用Excel 2007計算和分析，對百分率數據進行反正弦平方根轉換，其獨立樣本t檢驗和方差分析處理均采用SPSS 18.0版統計軟件進行統計學分析處理，多重比較采用Duncan修復極差法分析。

2 結果與分析

2.1雄蕊開花習性

‘馬漢’為典型雌蕊先熟型品種，雄花芽于3月中旬開始萌動，經9～12 d后芽開始綻開，芽綻開后長出3束葇荑花序，花序直挺，0.5～1.1 cm左右，斜上生長，此為初花期。4月中旬花序伸長，開始軟垂，雄花序迅速伸長，小花形成，并由深綠色變成淺綠色。4月下旬，花苞開放，花藥發育，每個花序由114～126朵小花組成。

圖1 薄殼山核桃散粉期雄花所處發育狀態比例Figure 1 Ratio ofmale flowers during four developmentstages

雄蕊散粉期經過花萼開裂→即將散粉期（花藥由綠變黃）→散粉初期（25%小花花藥開裂）→散粉盛期（50%以上小花花藥開裂）→散粉末期（花藥完全開裂，花序變黑，花粉基本散盡）→小花脫落的變化過程。雄蕊散粉周期短，且發育進程不一致。如圖1所示，5月6日花藥由綠變黃，占雄花比例的95.22%。此后，散粉雄花序比列逐漸增大，雄蕊進入散粉期。5月7日，散粉初期花序占44.79%，散粉盛期花序占11.90%，進入散粉的雄花序占到56.69%比例。5月8日，各散粉期比例呈明顯正態分布，散粉盛期花序比例增大，占46.60%，散粉比例達到75.29%，此時進入散粉盛期。5月9日，即將散粉期花序僅有4.57%，散粉盛期比例最大，達52.09%。5月10日，雄蕊進入散粉末期，比例為80.57%。散粉后，小花枯萎脫落，進入落花期。

2.2 不同散粉期花粉活力

如表1和表2所示：不同散粉期花粉生活力差異顯著，各時期花粉的耐儲藏性也差異顯著，表現為即將散粉期＞散粉初期＞散粉盛期＞散粉末期。在整個散粉過程中，即將散粉期和散粉初期花粉活力最高，達到90%以上，兩者之間無顯著性差異；散粉盛期花粉活力次之，花粉活力為88.39%；散粉末期花粉活力最差，僅為79.60%，與花藥黃色時期和散粉初期差異顯著。將4個時期的花粉在常溫干燥條件下儲藏，進行花粉活力比較（圖2），發現花藥黃色時期花粉活力下降最慢，與其他3個時期的花粉相比更耐儲藏，4 d之后花粉活力僅下降24.00%；散粉初期和散粉盛期花粉活力下降次之，兩者之間無顯著性差異，4 d后分別下降41.89%和44.11%，但與黃色花藥時期差異顯著；散粉末期花粉活力下降最快，4 d之后花粉下降74.00%，與之前3個時期花粉儲藏活力達到極顯著差異。

表1 薄殼山核桃散粉期花粉生活力Table 1 Pollen viability of pecan during pollination

表2 散粉期花粉活力方差分析Table 2 Comparison of pollen viability during pollination

2.3 不同儲藏條件下花粉活力

花粉散落后，其內部就開始發生一系列的生理代謝反應，活力逐漸衰退。隨儲藏時間的延長，花粉活力有明顯下降趨勢。由圖2表明：不同溫度處理下花粉活力-70℃超低溫＞4℃低溫＞常溫儲藏（圖3），在常溫、低溫、超低溫儲藏條件下花粉活力下降呈顯著性差異（表3和圖4）。在常溫條件下花粉儲藏時間最短。常溫儲藏4 d后花粉活力為66.34%，下降29.14%，10 d后下降69.25%，30 d之后花粉活力下降到7.08%，50 d后花粉已經完全喪失活力；在常溫密封干燥條件下花粉活力下降趨勢與常溫密封下無顯著性差異，10 d后，花粉活力下降59.95%，50 d后花粉也已經完全喪失活力。而4℃低溫條件下花粉活力儲藏時間比常溫儲藏時間更長，低溫密封儲藏4 d后花粉活力為71.04%，下降24.22%，與常溫密封條件下花粉活力差異顯著，10 d后下降39.03%，30 d后下降57.83%，90 d之后花粉活力下降到10.09%，120 d后花粉已經完全喪失活力；低溫密封干燥與低溫密封保存無顯著性差異，120 d后花粉也完全喪失活力。-70℃超低溫條件下保存效果最好，與常溫、低溫差異極顯著，儲藏50 d花粉活力仍有70.40%，僅下降24.91%，儲藏120 d花粉活力下降36.62%，儲藏360 d花粉活力還保持43.55%的活力，-70℃密封干燥要優于-70℃密封儲藏，但差異也不顯著，兩者分別下降了53.55%和47.43%。

3 討論

在農林業生產實踐中，為了進行人工輔助授粉或雜交授粉育種，需要早期采集花粉和儲藏花粉，并對花粉活力進行檢測［9-11］。花粉的采集時間是影響花粉活力的一個重要的因素。采集過早，花粉未完全發育,營養物質積累不夠充分，花粉少且活力低；采集時間過遲，則花多已散粉，影響花粉采集量［12］。作者參考曲柏宏等［13］通過花期物候觀察確定花粉成熟期，利用熒光染色反應（FCR）測定各散粉期花粉活力。研究結果表明：不同散粉期采集的花粉生活力差異顯著，從而確定最佳采粉時間是即將散粉期（花藥由綠變黃時期）。作者認為，在即將散粉期，花粉粒已經發育完全，而且花粉粒仍處于花粉囊中，避免花粉與空氣接觸而導致花粉活力降低，所以相比較散粉期的花粉更有利于運輸和保存，但這有待于進一步研究。

圖2 不同儲藏條件下花粉活力比較Figure 2 Comparison of pollen viability under different storage conditions

表3 不同儲藏條件下花粉活力方差分析Table 3 Variance analysisof pollen viability under differentstorage conditions

圖3 儲藏4 d后4個散粉期花粉活力對比Figure 3 Pollen vitality of four storage period after storing four days

圖4 儲藏6 d花粉活力對比Figure 4 pollen vitality of four storage period after storing six days

溫度是影響花粉儲藏活力的重要因素［14-16］，低溫能明顯阻止花粉的衰老，主要原因是降低了呼吸強度和酶的活性［17］。通過研究表明：不同儲藏條件對薄殼山核桃花粉活力有顯著影響，這與許多研究結果一致，而且溫度與花粉儲藏壽命呈負相關［18］。在室溫條件下，儲藏4 d花粉活力下降了30.00%，儲藏10 d就下降了70.00%。此方法儲藏時間短，所以在生產實踐上只能短期應用。在4℃低溫條件下，儲藏30 d花粉活力下降58.00%，儲藏90 d花粉活力下降90.00%，在一般生產實踐上低溫保存能夠應付花期不遇和雜交授粉等問題。在-70℃超低溫條件下保存1 a，花粉活力還能達到50.00%，可以用作來年的輔助授粉工作或應對散粉期陰雨天氣。近年來，由于應用了超低溫和冷凍干燥技術保存花粉，使花粉儲藏壽命大幅度延長［19］，為雜交育種、種質資源的保存提供了有力支持。

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Flowering characteristicsand pollen viability of Carya illinoensis‘Mahan’

YANG Xianyu1,HUANG Jianqin1,XU Kuiyuan2,XIA Guohua1,YUAN Ziqian1,3,
LING Hua1,WANG Zhengjia1
（1.The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China;2.Forest Enterprise of Jiande City,Jiande 311600,Zhejiang,China;3.Hangzhou Academy of Forestry,Hangzhou 310016,Zhejiang,China）

To promote collection and the effective conservation ofCarya illinoensis（pecan）pollen,male flowering habits and pollen vigor in four developmental stageswith different storage conditions［a）room temperature,b）room temperature and dry,c）4℃,d）4℃and dry,e）-70℃,and f）-70℃and dry］were observed using the fluorochromatic reaction（FCR）method.Results showed that on April 26th the bract in the catkins had cracked.By May 6th the anthers had turned from green to yellow;between May 7th and 9th,the pollen sac split shedding catkin pollen.As of May 8th about 75%of the shedding had occurred,and on May 10th when the catkins turned brown and fell from the trees,shedding was complete.The sequence for pollen viability was beginning of shedding＞early shedding＞heavy shedding＞final shedding with storage durability for the pollen having the same order.Pollen viability for different storage conditions followed decay curves,butdifferences were noted with-70℃and dry＞-70℃＞4℃and dry＞4℃＞room temperature and dry＞room temperature.Also,as storage time increased,pollen viability gradually decreased.The fastest decline in pollen viability was at room temperature,and after 50 d the pollen had completely lost its vitality.When stored at4°C, the pollen had mostly lost its vitality after 120 d.The best condition was preservation at-70℃where pollen was still 43.55%viable after 360 d.［Ch,4 fig.3 tab.19 ref.］

cash forestry；Carya illinoensis‘Mahan’；catkin development；pollen viability；storage conditions；fluorochromatic reaction（FCR）

S722.1；S664.1

A

2095-0756（2014）04-0528-06

2013-09-24；

2013-11-13

浙江省科學技術重大國際科技合作資助項目（2011C14010）；杭州市科技發展計劃資助項目（20130432B85）；浙江農林大學研究生科研創新基金資助項目（3122013240216）

楊先裕，從事經濟林栽培與利用。E-mail：hkyangxianyu6698@163.com。通信作者：王正加，教授，博士，從事林木遺傳育種研究。E-mail：wzj@zafu.edu.cn