柿子葉中熊果酸的超聲波輔助提取工藝研究

曾發(fā)揮　陳若菡

【摘 要】為了充分利用柿子葉中的熊果酸，以柿子葉為原料，以熊果酸提取率為指標(biāo)，采用超聲波輔助提取了柿子葉中的熊果酸。分別研究了乙醇濃度、料液比、超聲波時間和超聲波溫度對熊果酸提取率的影響。結(jié)果表明，熊果酸提取的最佳工藝條件是：乙醇濃度85%、料液比為1：12、超聲波時間為25min、超聲波溫度為45℃，在最佳條件下，熊果酸提取率可達1.131%。

【關(guān)鍵詞】柿子葉；超聲波；熊果酸；提取工藝

柿葉為柿樹科，柿樹屬植物柿的新鮮或干燥葉。柿葉味苦、性寒、無毒，治咳喘，肺氣脹以及各種內(nèi)出血。《滇南本草》記載“經(jīng)霜葉敷臁瘡”；《本草再新》記載“治咳嗽吐血，止咳生津”；《分類草藥性》記載“治咳嗽氣喘消肺氣脹”。據(jù)報道，柿葉也有抗癌、抗菌、抗衰老、誘導(dǎo)凋亡[1-3]以及對特異性皮炎的作用。經(jīng)科學(xué)研究柿子葉中含有黃酮類、鞣質(zhì)、香豆精類化合物和樹脂、還原糖、多糖及有機酸、胡蘿卜素等多種物質(zhì)，具有抗氧化、降血脂、通利血脈、清熱解毒、生津止渴的作用[4-5]。此外，柿子葉尚含有五環(huán)三萜類化合物，其中熊果酸是其主要成分之一。

熊果酸（ U rso licA cid，UA ），又名烏索酸、烏蘇酸，屬A- 香樹脂醇型五環(huán)三萜類化合物。純凈的熊果酸為白色針狀晶體，易溶于二氧六環(huán)和吡啶，可溶于甲醇和乙醇，微溶于丙酮、苯、氯仿和乙醚。近年來，有關(guān)熊果酸的提取已經(jīng)成為天然產(chǎn)物加工領(lǐng)域的研究熱點之一。隨著對熊果酸生物活性的深入研究，其在醫(yī)藥、食品、保健和化妝品等領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用[ 6 - 9 ] 。熊果酸在自然界分布很廣，是多種天然產(chǎn)物的主要活性成分。目前，熊果酸主要從女貞子、山楂、夏枯草、車前草和苦丁茶等植物中提取[10] ，而很少有在柿子葉中提取的報道，本文對柿子葉中熊果酸的提取工藝進行研究，旨在為以后的研究工作提供參考。

一、材料與方法

（一）材料及儀器

干柿葉，采集于贛南醫(yī)學(xué)院新校區(qū)（圓形紅柿）洗凈、干燥、粉碎后備用；熊果酸對照品，北京澳天茂森生物技術(shù)研究院；所用化學(xué)試劑中無水乙醇、高氯酸、香草醛、冰醋酸、乙酸乙酯等均為分析純。

Lambda 35 UV/vis spectrometer紫外可見分光光度計、電子天平、SHB -3型循環(huán)水多用真空泵、DZF-6050型真空干燥箱、HHS- 2型電熱恒溫水浴鍋、FW 177粉碎機和Lucky 數(shù)控超聲波清洗機等。

（二）實驗方法

（1）熊果酸的提取

取2 g柿子葉粉，加入適量的浸提液，攪拌，控制超聲波溫度為45℃，超聲波處理25m in。處理后浸泡1 h，然后抽濾，取0. 2mL濾液移至試管中，減壓蒸干。冷卻后加0. 3 mL5% 香草醛- 冰醋酸和0. 8mL的高氯酸，60℃水浴加熱15min，冷卻至室溫，用乙酸乙酯定容至5 mL，在549 nm波長處測吸光度。

（2）產(chǎn)品的紫外分析

精密量取0. 5mL柿子葉提取溶液，同時量取0. 5mL濃度為0. 2mg /mL的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別置于具塞試管中，加熱揮去溶劑后，加5% 香草醛- 冰醋酸0. 3 mL 和高氯酸0. 7 mL，然后在60℃水浴中加熱15 min，取出冷卻至室溫。用乙酸乙酯定容至5mL，搖勻，用Cary 50紫外分光光度計進行紫外掃描分析，掃描熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品和產(chǎn)品的最大吸收波。

（3）熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用無水乙醇定容于100mL容量瓶中，即得0. 1 mg /mL 的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密吸取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9 和1. 0 mL 置于具塞試管中，加熱揮去溶劑后，加5% 香草醛- 冰醋酸0. 3 mL和高氯酸0. 8 mL，60℃水浴中加熱15 min，取出冷卻后移至5 mL聚酯試管中，用乙酸乙酯定容，搖勻后在549 nm處測定吸光度，同時以試劑空白作參比，以吸光度為縱坐標(biāo)，熊果酸濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

從圖1可以看出，R2 = 0. 9991，說明熊果酸濃度在2～ 10 ug /mL，具有良好的線性關(guān)系。

（4）熊果酸提取率的計算方法

式中：Y——熊果酸提取率，%；V——提取液體積，ml；X——熊果酸濃度，μg/ml；W——柿子葉樣品質(zhì)量，g。

二、結(jié)果與討論

（一）產(chǎn)品的紫外分析

對標(biāo)準(zhǔn)品和產(chǎn)品進行紫外分析， 結(jié)果如圖6和圖7所示。

由圖6 可知，熊果酸的最大吸收波長在549nm 附近。由圖7可知柿子葉提取液在549 nm處出現(xiàn)明顯的紫外吸收，由此可以判斷出柿子葉中的提取物為熊果酸。

（二）單因素實驗

（1）乙醇濃度對熊果酸提取率的影響

按上述試驗方法，在超聲波時間為30min、超聲波溫度為50℃和料液比為1：12的條件下，分別取乙醇濃度為75%、80%、85%、90% 和95% 進行試驗，計算提取率，結(jié)果如圖2所示。

圖.2 乙醇濃度對提取率的影響

從圖2可看出當(dāng)濃度< 85% 時，隨著濃度的增大，熊果酸的提取率顯著增加，并在濃度為85%時提取率達到最大；濃度> 85%時，熊果酸的提取率明顯下降。故乙醇濃度以85%為宜。

（2）料液比對熊果酸提取率的影響

按上述實驗方法，在超聲波時間為30min、超聲波溫度為50℃和乙醇濃度為85%的條件下，液料比分別取1：4、1：6、1：8、1：10、1：12和1：14進行試驗，計算提取率，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，料液比對熊果酸的提取率有顯著的影響，隨著溶劑添加量的增加，熊果酸的提取率逐漸增大，當(dāng)料液比達到1：10時，浸提可達到比較理想的效果。此時再增加提取溶劑量對提取率影響不大。考慮到生產(chǎn)成本，故料液比以1：10為宜。

（3）超聲波時間對熊果酸提取率的影響

按上述實驗方法， 在乙醇濃度為85% 、超聲波溫度為50℃和料液比為1：12的條件下，超聲波時間分別取10、20、30、40和50 min進行試驗，計算提取率，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可看出，隨著超聲波時間的延長，熊果酸的提取率也在增加，當(dāng)超聲波時間達到20 min的時候，提取率顯著增加，到30 min的時候達到最大值；當(dāng)超聲波時間超過30 min后，提取率開始下降。這是由于提取過程需要一定的超聲波時間，超聲波時間太短，熊果酸得不到完全的游離，超聲波時間過長，過多的醇溶性物質(zhì)得到游離，從而與熊果酸競爭溶劑，使得熊果酸的提取率下降，故超聲波時間以30 min為宜。

（4）超聲波溫度對熊果酸提取率的影響

按上述試驗方法，在乙醇濃度為85%、超聲波時間為30 min和料液比為1：12 的條件下，超聲波溫度分別取30℃、40℃、50℃、60℃和70℃進行試驗，計算提取率，結(jié)果見圖5所示。

由圖5可看出，在溫度低于50℃ 時，隨著超聲波溫度的升高，熊果酸的提取率呈顯著上升趨勢，當(dāng)溫度超過50℃的時候，熊果酸的提取率增加緩慢，上升趨勢不明顯。故超聲波溫度以50℃比較理想。

三、結(jié)論

通過產(chǎn)品的紫外分析表明，柿子葉提取物在549 nm處出現(xiàn)明顯紫外吸收，與熊果酸在549 nm處的特征吸收峰相符合，說明柿子葉提取物為熊果酸。

通過分別研究了乙醇濃度、料液比、超聲波時間和超聲波溫度對熊果酸提取的影響，結(jié)果表明柿子葉中提取熊果酸的最佳工藝條件為：乙醇濃度為85% 、料液比為1：12、超聲波溫度為45℃和超聲波時間為25min。在最佳提取工藝條件下，提取率為1. 131% 。