益胃祛瘀消痰方對慢性萎縮性胃炎大鼠胃組織細胞凋亡及相關基因表達的影響*

河北省任丘市衛生學校 劉連臣 張睦清 杜志超（任丘 062550）

益胃祛瘀消痰方為經多年臨床篩選出的治療慢性萎縮性胃炎 （CAG）的經驗方，具有益氣養陰，祛瘀消痰之功，臨床用于治療CAG具有較好的療效。本研究采用流式細胞術 （FCM）觀察了益胃祛瘀消痰方對CAG大鼠胃組織細胞凋亡與增殖及其相關調控基因Caspase3、Bcl－2和Fas基因蛋白表達的影響，以研究益胃祛瘀消痰方在治療CAG方面的作用機理。

1 材料

1.1 實驗動物 Wistar大鼠，60只，雄性，體質量180～200 g，購自河北省實驗動物中心 （合格證號:冀動字1001005）。

1.2 藥物和試劑 益胃祛瘀消痰方藥物組成:黃芪、丹參、麥冬、炒白芍、炒白術、炙甘草、清半夏、黃連、丁香、陳皮等，采用水煎和醇提相結合方法，將提取液分別濃縮為含生藥0.367 g/mL、0.183 g/mL濃度的水溶液。三九胃泰膠囊和維霉素片均用蒸餾水制成0.1 g/mL濃度的混懸液。脫氧膽酸鈉購自北京奧博星生物技術有限公司。Fas、Bcl－2和Caspase3一抗單克隆抗體、二抗工作液（羊抗鼠PITC－IgG熒光抗體）均由美國Santa Cruz公司提供。

1.3 主要儀器 Epics－XLⅡ型流式細胞儀，美國Beckman Coulter公司生產。

2 方法

2.1 動物分組與造模 將實驗大鼠常規喂養1周后，隨機分為正常組、模型組、維霉素組、三九胃泰組、益胃祛瘀消痰方低劑量組、益胃祛瘀消痰方高劑量組，共計6組。動物造模參照相關文獻采用的方法［1］即:先灌飼0.2%的脫氧膽酸鈉溶液，用量為每只1.5 mL/d，5 h以后，再灌飼50℃的熱水，用量為每只2 mL/d，同時加用饑飽失常的喂養方法，（2 d足量喂食，1 d停食），正常組大鼠普通飼料喂養，每天灌飼等量的蒸餾水，造模時間共8周。

2.2 給藥方法 造模成功后，開始灌胃治療，其中，益胃祛瘀消痰方低劑量組和高劑量組分別按照1.83 g/kg、3.67 g/kg的劑量灌胃，維霉素組和三九胃泰組均按照1g/kg的劑量灌胃，正常組和模型組均給予等劑量的蒸餾水灌胃;1次/d，用藥體積均按照1 mL/100 g計算。

2.3 胃組織樣本制作 治療5周后，麻醉實驗大鼠，股動脈取血后，迅速剖開腹部，分離胃組織，沿胃竇近幽門口至胃大彎方向取適量的胃組織，于生理鹽水中沖洗后，以70%乙醇溶液固定，置于冰箱中冷藏待檢。

2.3.1 制備單細胞懸液:將固定的胃組織放置于100目的不銹鋼網上，網下置一平皿，用剪刀剪碎至1 mm3大小，再用眼科鑷子輕搓組織塊，邊搓邊以PBS液沖洗，直至將組織搓完。然后將平皿中的混懸液，用300目篩網過濾以去除細胞團塊，收集細胞懸液，500～800 r/min離心2 min，棄去上清，保留沉淀，加入PBS 0.3 mL，稀釋混勻后，將單細胞懸液分成4份，調整每份的細胞數為1×106，分別用于檢測細胞凋亡、Caspase3、Bcl－2和Fas蛋白表達。

2.3.2 細胞凋亡DNA含量染色:取1×106細胞懸液0.1 mL，加入10%雞紅細胞作為內參標準，與樣品同步染色，加入碘化丙啶 （PI）1 mL，在4℃冰箱染色30 min，以500目銅網過濾，上機檢測。

2.3.3 Bcl－2、Caspase3、Fas蛋白免疫熒光標記:將鼠抗人單克隆抗體工作液0.1 mL，加入到單細胞懸液1×106/mL中，室溫孵育30 min，加入PBS 10 mL洗滌1次，棄去上清液，加入羊抗鼠PITC－IgG二抗工作液100μL，室溫孵育30 min，加入PBS 10 mL離心，棄去上清，除去未結合的熒光二抗，再加入PBS 0.1 mL并用500目的銅網過濾后，即可上機檢測。在對蛋白免疫熒光標記物測定時，設一抗或二抗的本底作為對照和陰性對照。

2.3.4 檢測方法:采用Epics－XLⅡ型流式細胞儀，檢測前以 flow－checkTMFluorpheres（10μm）熒光微球作為標準樣品調整儀器CV值在2%以內。

2.4 測量資料分析方法 應用MuticycleAV分析軟件對DNA細胞周期擬合分析，應用Expo32ADC進行免疫熒光數據分析，以細胞凋亡指數 （AI）表示細胞凋亡程度，細胞增值指數 （PI）代表細胞的增值活性，免疫熒光指數 （FI）表示蛋白表達水平。

3 結果

3.1 益胃祛瘀消痰方對CAG大鼠胃組織細胞凋亡的影響 模型組與正常組比較，胃組織細胞AI值、G0/G1期細胞百分率均明顯升高 （P＜0.01）;PI值和 G2/M期以及 S期細胞百分率降低 （P＜0.05）。經藥物治療后，與模型組相比，各治療組G0/G1期細胞百分率和AI值均明顯下降 （P＜0.01）;G2/M期以及S期細胞百分率和PI值均明顯增高 （P＜0.01或P＜0.05）;其中，高、低劑量組AI值均低于維霉素組和三九胃泰組 （P＜0.05或P ＜0.01）。結果詳見表1。

表1 各組大鼠胃組織細胞凋亡及不同時期增殖時相比率的結果比較（±s），n=10

表1 各組大鼠胃組織細胞凋亡及不同時期增殖時相比率的結果比較（±s），n=10

注:與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與維酶素組和三九胃泰組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 AI G0/G1（%） G2/M（%） S（%）PI正常組 10.31±1.51＊＊ 75.68±6.24＊＊ 9.51±0.66* 14.42±1.55* 23.96±2.46＊＊模型組 24.46±3.12 80.89±8.85 7.73±0.88 11.28±0.92 18.96±1.83高劑量組 14.55±2.78＊＊△△ 73.21±7.71＊＊ 11.55±1.75＊＊ 15.16±1.16* 26.59±2.37＊＊低 劑 量組 15.84±3.03＊＊△ 74.48±8.92＊＊ 11.41±1.92＊＊ 15.38±0.52＊＊ 26.81±3.02＊＊維霉素組 17.83±2.89＊＊ 75.83±6.84＊＊ 10.82±1.52＊＊ 14.18±1.73* 24.92±2.63＊＊三九胃泰組 17.41±3.88＊＊ 75.49±5.65＊＊ 11.16±1.28＊＊ 13.69±0.88* 24.89±1.13＊＊

3.2 益胃祛瘀消痰方對CAG大鼠胃組織細胞Caspase3、Bcl－2、Fas蛋白表達的影響 模型組與正常組比較，大鼠Caspase3和Fas蛋白表達FI值均升高，而 Bcl－2蛋白表達 FI值降低 （P＜0.01或P＜0.05）。經用藥治療后，各治療組Fas、Caspase3蛋白表達FI值均低于模型組，Bcl－2蛋白表達FI值均高于模型組 （P＜0.05或P＜0.01）;其中，高、低劑量組的Caspase3蛋白表達FI值均低于維霉素組和三九胃泰組 （P＜0.05或P＜0.05）;高劑量組Fas蛋白表達FI值低于低劑量組、維霉素組和三九胃泰組 （P＜0.05或P＜0.01）。結果詳見表2。

表2 各組大鼠胃組織細胞Caspase3、Bcl－2、Fas蛋白表達變化（±s），n=10

表2 各組大鼠胃組織細胞Caspase3、Bcl－2、Fas蛋白表達變化（±s），n=10

注:與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與維酶素組和三九胃泰組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別Caspase3 FI Fas FI Bcl－2 FI正常組 1.03±0.01＊＊ 0.83±0.13＊＊ 1.00±0.15＊＊模型組 1.32±0.03 1.28±0.21 0.74±0.21高劑量組 1.06±0.02＊＊△ 0.89±0.12＊＊△△ 0.98±0.19＊＊低劑量組 1.07±0.03＊＊△ 1.08±0.23* 0.95±0.11＊＊維霉素組 1.18±0.03＊＊ 1.12±0.21* 0.92±0.08＊＊三九胃泰組 1.16±0.02＊＊ 1.06±0.18* 0.97±0.11＊＊

4 討論

中醫學中無CAG的病名，根據其臨床表現可歸屬于中醫的“胃痞”“胃脘痛”“嘈雜”等疾病范疇，其病因多是由于飲食不節、或情志不遂、或操勞過度，損傷脾胃等，漸致脾胃損傷，氣機失調，胃絡瘀阻，濕阻痰生。氣陰不足，痰瘀互阻為本病的主要病機，益氣養陰，祛瘀消痰為其有效治療方法。故益胃祛瘀消痰方中選用黃芪、白術、茯苓益氣健脾，麥冬、炒白芍、炙甘草酸甘化陰，柔肝和胃，丹參、赤芍、莪術活血祛瘀，清半夏、白芥子燥濕消痰，陳皮、黃連、丁香通降胃氣。諸藥合用，脾氣得補，胃陰得充，氣機得暢，血脈暢通，濕祛痰生，故治療CAG可獲滿意的療效。

胃組織細胞的過度凋亡，可嚴重影響胃的生理功能。Bcl－2與Fas是與細胞凋亡關系較為密切的基因，兩者的作用各不相同。Bcl－2基因主要作用是通過抗細胞凋亡，以延長細胞壽命，促進細胞生存 。［2］Fas基因為細胞膜表面受體蛋白，它是與T淋巴細胞膜上Fas－L結合，向細胞內傳遞“死亡信號”，誘導靶細胞發生凋亡［3］，Caspase3是Caspase家族成員之一，是哺乳動物細胞凋亡中的關鍵蛋白酶，Caspase3介導的凋亡在人體多種類型細胞中普遍存在著，其降解凋亡標志性底物的活性最強。Caspase3可被該家族其它成員如Caspase9和6激活。Bcl－2，Bcl－xL等抗凋亡蛋白可通過與Fas等促凋亡蛋白形成異二聚體阻止線粒體釋放細胞色素 C（cyt－c），或直接與 a－paf－1、Caspase9結合成三元復合物從而阻止Caspase9途徑的激活，Caspase3不能被活化，因而細胞凋亡受抑制。［4］本項研究結果表明，模型組大鼠的胃組織中細胞凋亡率最高，同時 Bcl－2表達量最低，Caspase3和Fas表達量最高;說明Caspase3和Fas表達上調、Bcl－2表達下調，是造成細胞凋亡增加的原因之一。經藥物治療后，與模型組相比，各治療組Bcl－2表達量明顯增加，Caspase3和Fas表達量明顯降低，細胞凋亡率明顯下降，說明益胃祛瘀消痰方能夠加速胃組織細胞的DNA合成及分裂增殖，抑制胃組織細胞過度凋亡，以保證胃組織細胞的正常功能，從而達到抗CAG的作用，此可作為益胃祛瘀消痰方治療CAG的作用機制之一。

［1］ 李紅平，毛萬姬，鄒學正.丹白麥門冬湯對慢性萎縮性胃炎大鼠胃黏膜病理形態學的影響 ［J］.陜西中醫，2007，28（2）:243－245

［2］ LalierL，Cartron PF，Juin P，et a1.Bax activation and mitochon－ drial insertion during apoptosis ［J］ .Apoptosis，2007，12（5）:887－896

［3］ Lockshin RA.Programmed celldeath:history and future ofa con －cept［J］ .JSoc Biol，2005，199（3）:169 －73

［4］ 于利利，王澤華.Bcl－xL和Caspase3在人卵巢癌細胞株凋亡過程中的調節作用 ［J］.華中科技大學學報 （醫學版），2003，32（2）:205－207

（2014－03－07 收稿）