多不飽和脂肪酸對大鼠大腦細胞膜脂肪酸組成的影響

岳 崟，葉 誠，鄭冬冬，王麗梅 *，劉烈炬

（1.武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023；2.湖北出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，湖北 武漢 430050）

脂肪酸是構成生物體的基本成分，也是機體必需的營養物質。腦組織的重要成分是脂肪酸，占大腦干質量的10%以上[1]，其含量和密度與大腦的生長發育功能密切相關[2]。多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）也是組成大腦的重要成分，其在大腦中的含量以及其中n-3、n-6的比例對大腦學習記憶功能有很大影響[3-7]；PUFAs也是細胞膜的重要組成成分，解剖學的研究曾證明PUFAs對維持神經細胞膜的結構、細胞膜的流動性、神經突觸的正常結構以及突觸可塑性起了重要的作用[8-10]，但PUFAs發揮生理功能的機制尚未明確，并且研究大腦細胞膜中脂肪酸種類與含量的報道較少，也主要集中于研究一種脂肪酸的作用。因此研究攝入不同類型的PUFAs對大鼠大腦細胞膜脂肪酸的組成與含量的影響，有利于闡明不同家族的PUFAs發揮生理功效的可能原因（是否與影響大腦細胞膜脂肪酸的成分與含量有關），也有利于進一步研究PUFAs發揮作用的可能機制。該實驗研究不同類型PUFAs對細胞膜中脂肪酸種類與含量的影響，為深入研究PUFAs的生理功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

清潔級SD雄性大鼠56只，初斷乳，體質量（85±10）g，購于華中科技大學同濟醫學院，動物許可證號SCXK2010-0009。

普通飼料（配方：玉米45%、三等粉25%、麩皮10%、魚粉5%、豆粕10%、骨粉4%、鹽0.5%、多維0.2%），購自華中科技大學同濟醫學院實驗動物部；特殊飼料（扣除不飽和脂肪酸的飼料，配方：玉米18%、魚粉4%、麩皮12%、面粉33%、豆粕31.5%、骨粉1%、鹽0.5%），購自湖北省實驗動物研究中心。

魚油：湖北福星生物科技有限公司；紫蘇油：湖北李時珍保健油有限責任公司；核桃油：湖北李時珍保健油有限責任公司；紅花油：新疆塔城紅花緣科技有限公司；α-亞油酸：鄭州眾信化工有限公司；羧甲基纖維素鈉：連云港友進食品添加劑有限公司；Tris-HCl 0.05mol/L；NaOH-CH3OH 0.15mol/L；正己烷（分析純）：天津市天力有限公司。

1.2 儀器與設備

WH-1微型漩渦混合儀：上海滬西分析儀器廠有限公司；5mL手動玻璃勻漿器：寧波新芝科器研究所；TGL-16M型高速離心機：長沙平凡儀器儀表有限公司；KQ2200V超聲波破碎儀：昆山市超聲儀器有限公司；PL402-L分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；DHG-9145A干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；Agilent 7890 GC/5975C氣相色譜質譜聯用儀：美國Agilent公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與喂養

56只初斷乳雄性SD大鼠置于標準動物房飼養，適應一周后，隨機分成陰性組；必需脂肪酸（essential fatty acids，EFA）缺乏組；n-3PUFAs組（魚油組[300mg/（kg·d）]、紫蘇組[2.45mL/（kg·d）]；n-6PUFAs組（α-亞油酸組[1.32g/（kg·d）]；核桃組[2.45mL/（kg·d）]；紅花組[1.65g/（kg·d）]。此劑量參照郭艷芬等[11]的研究，根據大鼠體質量給油（每3d稱質量1次）。陰性組飼喂普通飼料，EFA缺乏組飼喂特殊飼料，2組均灌胃相應劑量5‰的羧甲基纖維素（carboxymethyl cellulose，CMC）溶液，連續灌胃給油8周。

1.3.2 大腦組織總細胞膜的提取與甲酯化

大鼠禁食12h后，1.2g/kg烏拉坦麻醉（現配），斷頭處死，迅速于冰上剝離大腦組織，預冷生理鹽水漂洗并剔除血液與結締組織。然后轉移至勻漿器，加入Tris-HCl溶液，研磨；勻漿后，于4℃、3 000r/min離心20min；棄上清液，Tris-HCl重懸沉淀，4℃超聲破膜30min，將破膜細胞懸液于4℃、3 000r/min離心20min；去沉淀，上清液4℃、10 000r/min離心20min，棄上清，留沉淀，并重復上述步驟1次，得沉淀即為細胞膜。

甲酯化方法參照國際油脂中心發布的最新分析方法[12]，取5mL的正己烷加入1.0g的細胞膜中，充分振蕩10min，使其充分溶解，然后加入0.15mol/L的NaOH-CH3OH溶液2mL，振蕩搖勻于50℃水浴鍋中甲酯化30min，完全甲酯化后用于進樣；魚油標準品的甲酯化方法同上。

1.3.3 氣相色譜-質譜分析

色譜條件：色譜柱為DB-WAXETR（30m×0.25mm×0.25μm）；采用程序升溫法：起始溫度為140℃，保持2min，然后以10℃/min 升至160℃后保持3min，最后以2℃/min的速度升溫至240℃，保持3min。載氣為N2（99.999%），氫氣流量為2 mL/min，分流比為50∶1，前進樣口溫度250℃，檢測器溫度280℃。質譜電離條件：70eV，掃描分子量：50～450amu。譜庫：Wiley/NBS，NIST。

1.3.4 統計學方法

實驗結果用“x±s”表示，使用SPSS19.0對數據進行分析，多組間比較，用ANVON方法分析，組間比較，用T檢驗分析，并且認為P＜0.05有統計學意義，P＜0.01有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 各組細胞膜脂肪酸的組成

該實驗條件下，各組大鼠大腦細胞膜脂肪酸得到完全分離，各組均檢測到：C12：0、C14：0、C15：0、C16：0、C18：0、C16：1、C17：1、C18：1、C16：2、C16：3、C18：3、C20：3、C16：4、C20：4、C20：5、C22：5、C22：6，各組大鼠細胞膜中脂肪酸的種類無差別。

2.2 各組細胞膜脂肪酸的相對百分含量

使用峰面積歸一法，測得各組大鼠細胞膜脂肪酸的相對百分含量，詳見表1。與陰性組和EFA缺乏組相比，其余各組均能顯著提高C20：3（P＜0.05和P＜0.01）的含量，顯著減少C16：1（P＜0.01）的含量；與陰性組相比，除α-亞油酸組外，其余各組均能顯著提高C18：0、C18：1、C22：5（P＜0.01）減少C12：0、C14：0、C15：0、C16：2、C18：3、C16：4的含量，而與EFA缺乏組相比，以上脂肪酸除陰性組以外，其余組均有顯著性差異（P＜0.05和P＜0.01）；與陰性組和EFA缺乏組相比，魚油組與紅花組能顯著提高C22：6、C20：4的含量（P＜0.05和P＜0.01）；與陰性組和EFA缺乏組相比，紅花組、紫蘇組、核桃組能顯著提高C20：5的含量（P＜0.05和P＜0.01）；只有魚油組檢測到C20：0；EFA缺乏組與陰性組比較，沒有顯著性差異，無統計學意義。

其中值得關注的是C22：6二十二碳六烯酸（docosa hexaenoic acid，DHA）、C20：5二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）、C20：4花生四烯酸（arachidonic acid，AA）、C18：3亞麻酸（α-linolenic acid，ALA）。由表2可以看出，只有魚油組與紅花組大鼠大腦膜DHA的含量相比陰性組與EFA缺乏組顯著提高（P＜0.05和P＜0.01），而其余組無顯著性差異，若魚油組與紅花組相比，魚油組DHA的含量比紅花組含量顯著增高（P＜0.01）；在EPA的比較中，紫蘇組、核桃組、紅花組比陰性組與EFA缺乏組的含量顯著增高（P＜0.05和P＜0.01），但是這兩組的EPA含量之間相比，無顯著性差異；在AA的比較中，只有魚油組與紅花組的含量較陰性組有顯著性差異（P＜0.05），魚油組含量較EFA缺乏組具有顯著性差異（P＜0.01），魚油組與紅花組相比具有顯著性差異（P＜0.01）；在ALA的含量比較中，除了α-亞油酸組外，其余各組較陰性組與EFA缺乏組均具有顯著性差異（P＜0.01）。

表1 不同油脂對大鼠大腦細胞膜脂肪酸相對含量的影響Table 1 Effect of different oils on the relative content of fatty acids in cerebral cytomembrane of rats

2.3 各組細胞膜不同類型脂肪酸的比較

根據表1的統計結果，將每組脂肪酸進行分類，分析不同類型的PUFAs對細胞膜不同類型脂肪酸的影響，見表2。與陰性組和EFA缺乏組相比，紫蘇組、核桃組與紅花組均能顯著提高細胞膜中飽和脂肪酸的總含量，顯著減少n-6PUFAs與單不飽和脂肪酸的含量（P＜0.05和P＜0.01），而紫蘇組與核桃組單不飽和脂肪酸總量只有和陰性組比較具有顯著性差異（P＜0.05）；魚油組、紅花組、紫蘇組與核桃組能顯著提高細胞膜中n-3PUFAs的總含量（P＜0.01）；與陰性對照組相比，魚油組、核桃組與紅花組能顯著提高DHA/AA的比值，而與EFA缺乏組比較，只有魚油組與紅花組能提高其比值；與陰性組和EFA缺乏組相比，魚油組、紫蘇組、核桃組與紅花組均能顯著提高細胞膜n-3PUFAs/n-6PUFA的比值，各組PUFAs的總量與MUFA/PUFA的比值無顯著性差異。

表2 大鼠大腦細胞膜脂肪酸的分類比較Table 2 Comparison of different fatty acids in cerebral cytomembrane of rats

3 討論

細胞膜是細胞與周圍環境聯系的紐帶，脂肪酸是構成生物膜的重要成分[13]，具有重要的生理功能，與細胞識別、免疫以及種族特異性相關[14]，其中發揮重要功能的有PUFAs，有研究證明PUFAs在大腦的組成與含量與阿爾茨海默病的發病率有關[15]，其中非常重要的就是n-3PUFAs的DHA，有動物實驗證明，攝入DHA可以增加DHA在腦內的含量[13，16]，從而調節大腦發揮生理功能；α-亞麻酸是極其重要的PUFAs，是n-3PUFAs的前體，對中樞神經系統起著極其重要的作用[17，18]；AA和α-亞油酸也是極其重要n-6PUFAs，α-亞油酸是AA的前體，其與大腦的細胞膜、結構以及功能都密切相關[19]。因此討論不同的PUFAs在大腦細胞膜的含量意義重大。

由實驗結果可以看出，PUFAs對大腦總細胞膜脂肪酸的類別無影響，說明補充不同類別的PUFAs，不能改變細胞膜脂肪酸的成分。在對脂肪酸含量的比較中n-3PUFAs組的魚油組與n-3PUFAs組的紅花組能顯著提高大腦細胞膜中DHA與AA的含量，這與齊可民[20]、CALON F等[13，16]的研究結果一致，但魚油組中DHA、AA的含量較紅花組顯著增多，其余組與陰性組相比也沒有統計學意義。

攝入不同類型的PUFAs能顯著提高n-3PUFAs在細胞膜中的含量，并且n-3PUFAs組與n-6PUFAs組的作用相差不大；攝入紫蘇油、核桃油和紅花油能有效降低n-6PUFAs的含量，增加飽和脂肪酸的含量；除攝入α-亞油酸以外，攝入其余油脂均能有效減少單不飽和脂肪酸的含量，提高細胞膜中n-3PUFAs/n-6PUFA的比值；攝入魚油、核桃油和紅花籽油能有效提高細胞膜中DHA與AA的比值；缺乏EFA對細胞膜脂肪酸的種類與含量沒有影響，這可能與EFA的缺乏時間有關，短期缺乏EFA對細胞膜脂肪酸的組成無影響。由實驗結果可以引申出更加深層的問題，為什么單獨攝入α-亞油酸與攝入主要含α-亞油酸的油脂，對細胞膜脂肪酸影響不同，是否與油脂中的其他活性成分相關？在受到PUFAs作用后，細胞膜n-3與n-6PUFAs的含量和比值發生變化，DHA/AA的比值發生變化，可能介導的下一步反應是什么？目前研究n-3PUFAs的作用略多，并且已經有大量的結論表明n-3PUFAs在腦細胞，組織和維持人體健康方面發揮了重要的作用[23]。PUFAs在細胞膜中的種類與含量的變化與PUFAs的生理功能之間的聯系以及可能的機理，也有待進一步研究。

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