紅曲洛伐他汀發酵條件優化及降脂功能

趙秀舉，劉志國

（武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，農產品加工湖北省協同創新中心，湖北 武漢 430023）

洛伐他汀（lavostatin）也稱莫那可林K（Monacolin K，MK），可以有效降低冠心病和心肌梗塞的發病率和死亡率。洛伐他汀主要用土曲霉（Aspergillus terreus）和紅曲霉（Monascus rubber）經深層發酵制取，紅曲霉（Monascus rubber）不僅產生洛伐他汀，而且產生據推測為洛伐他汀生物合成的中間產物的聚酮類物質莫那可林J、L、X，具有很強的降低膽固醇、調節血脂的功能。功能紅曲是紅曲霉（Monascus）繁殖于大米等糧食作物上的制品，可藥食兼用。含有豐富的酶系和多種生理活性物質如莫那可林K、麥角固醇、γ-氨基丁酸、天然植物激素等代謝產物，具有極高的營養、保健藥用價值，是天然安全有效的保健食品、藥品原料。在膽固醇的合成途徑中，羥甲基戊二酰輔酶A（hydroxyl methyl glutaryl-coenzyme A，HMG-CoA）還原酶起限速性關鍵作用，而Monacolin類化合物（Monacolin J、K、L、M、X）是HMG-CoA還原酶的競爭性抑制劑，可以有效減少膽固醇的合成，其中Monacolin K的活性最為顯著[1-5]。研究結果表明，功能紅曲能有效降低體內總膽固醇以及甘油三酯、低密度脂蛋白水平，同時升高高密度脂蛋白水平，從而具有顯著的降膽固醇及降血脂的作用；其中的Monacolin K多為酸式，其空間結構與體內羥甲基戊二酸輔酶A（HMG-CoA）還原酶更為接近，活性較內酯式高約一倍，無需水解直接發揮抑制體內膽固醇合成的作用[6-9]。

作為功能紅曲的主要成分，優化Monacolin K的產量成為發酵過程的重要內容。同時，功能紅曲中的其他成分，如紅曲色素是否參與及如何參與降血脂的機理還不清楚。本研究從培養溫度及持續時間入手，采用多變量分析的方法優化MK產量。同時利用細胞實驗考察MK、功能紅曲米的降脂效果及機理[10-15]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅曲（Monascus ruber）：中國科學院微生物所；洛伐他汀標準品：美國Sigma公司；肝L02細胞：美國標準生物品收藏中心；早秈米：湖北武漢白沙洲農副產品大市場；醋酸、葡萄糖、酵母膏、MgSO4、NaNO3、瓊脂：申試化工有限公司。

培養基：葡萄糖5%，酵母膏1%，MgSO40.1%，NaNO30.2%，pH 4～5，滅菌（123℃、30min）。

1.2 儀器與設備

HP1100高效液相色譜儀：美國Agilent公司；YPL-1回轉式恒溫調速藥瓶柜、WJ恒溫培養箱：上海新苗醫療器械公司；TDL-40B離心機、YP600電子天平：上海安亭儀器廠；JNOEC XS-212-201生物顯微鏡：南京江南永新光學有限公司；7500 PCR儀：美國Rockwell Allen-Bradley公司。

1.3 方法

1.3.1 紅曲發酵產洛伐他汀工藝流程

原料（早秈米）預處理（蒸米102℃、3～5min，涼米至40～50℃）→菌種兩級擴大培養（試管菌種→一級三角搖瓶菌種→二級三角搖瓶菌種）→接種（接種量20%）→高溫培養（28～39℃，3～6d）→低溫培養（17～25℃，10～18d）→烘干（60℃以下，水分≤6%）→包裝

1.3.2 MK含量測定方法

發酵所得紅曲米粉碎過60目篩后用甲醇萃取，采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定莫那可林K（MK）含量。

色譜條件：色譜柱Zorbax SBC18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈/磷酸水體積分數為65∶35；柱溫25℃；紫外檢測波長238nm；流量1mL/min；進樣量20μL；紅曲米甲醇萃取液經0.45μm濾膜過濾后用HPLC進行測定[16]。

1.3.3 正交試驗設計優化固態發酵條件

分別考察高溫持續時間，低溫持續時間，裝料量對MK產量的影響。在單個因素試驗基礎上，以MK產量為考察指標，MK固態發酵條件優化正交試驗設計因素與水平見表1。

表1 固態發酵條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for optimization of solid fermentation conditions

1.3.4 細胞培養

將人的肝L02細胞置于25cm2培養瓶中，并放入CO2培養箱中培養，當細胞生長至70%融合時，將細胞培養瓶中的培養基倒掉，加入1×磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS），潤洗3次后倒掉PBS，加入1～2mL 0.25%胰酶，消化完畢后加入含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的改良杜氏伊格爾培養基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）高糖培養基3mL，輕輕吹打細胞使其脫落，將細胞懸液置于離心管中，低速離心5min，棄上清液，加入含有10%FBS的DMEM高糖培養基3mL，重懸細胞。取出一半的細胞液轉入新的細胞培養瓶中，之后分別向細胞培養瓶中添加飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）作為高脂模型及MK、功能紅曲米（functionalMonascusrice，FR）等干預物，正常組僅補足培養基，加入的培養基和干預物的總體積為3mL，37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養。

1.3.5 引物設計及PCR擴增條件

cDNA 使用oligo-（dT）15 引物根據Invitrogen公司使用手冊合成。PCR 引物使用Primer Premier 5.0 軟件設計，持家基因beta-actin 作為內控基因。PCR擴增程序為：首先95℃持續15min，接著94℃持續5s、58℃持續15s、72℃持續10s共40個循環。mRNA 相對含量使用2-ΔΔCt方法計算。統計差異由參數方法one-way ANOVA multiple range test和非參數方法Mann-Whitney U test進行分析，統計差異按照P＜0.05執行[15]。

2 結果與分析

2.1 高溫溫度及持續時間

高溫發酵5d的條件下，溫度對MK產量的影響見表2。由表2可知，35℃的高溫是紅曲發酵產MK的最適溫度。

表2 高溫溫度對MK產量的影響Table 2 Effects of high temperature on MK yield

在35℃的高溫條件下，持續時間對MK產量的影響見表3。由表3可知，5d的發酵時間MK產量最高。

表3 高溫時長對MK產量的影響Table 3 Effects of high temperature time on MK yield

2.2 低溫溫度及持續時間

低溫發酵15d的條件條件下，溫度對MK產量的影響見表4。由表4可知，22℃的低溫是紅曲發酵產MK的最適溫度。

表4 低溫溫度對MK產量的影響Table 4 Effects of low temperature on MK yield

在22℃的低溫下，持續時間對MK產量的影響見表5。由表5可知，18d的發酵時間MK產量最高20.8‰，但考慮到15d時的MK產量20‰與20.8‰相差甚微且減少3d的時間對于利用空間和減少能源消耗有利，所以選用15d的低溫發酵時間。

表5 低溫時長對MK產量的影響Table 5 Effects of low temperature time on MK yield

2.3 容器體積

在裝料比均為36%的前提下，固體發酵容器體積對MK的影響見表6。由表6可知，1L三角瓶的MK產量最高。容器體積主要通過接觸面積、傳熱等因素對MK生成量產生影響。

表6 發酵容器體積對MK產量影響Table 6 Effects of the volume of fermentation container on MK yield

2.4 裝料量

在1L發酵體積的前提下，裝料量對MK產量影響見表7。由表7可知，36%的裝料量MK生成量最高。

表7 裝料量對MK產量影響Table 7 Effects of the loading volume on MK yield

2.5 固態發酵條件優化正交試驗結果

高低溫持續時間及裝料量之間可能存在交互作用；在高溫35℃、低溫22℃的條件下，綜合考慮高溫溫度持續時間，低溫溫度持續時間，裝料量等因素的影響，以MK產量為考察指標，正交試驗結果與分析見表8。

由表8結果表明，影響MK產量的因素順序為C＞A＞B，即裝料量對MK產量的影響最大，高溫發酵時長最小。A2B2C2為最優水平組合，即高溫發酵5d，高溫發酵15d，裝料量360g/L。在該最佳條件下進行驗證試驗，MK產量為24‰。

表8 固態發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 8 Results and analysis of orthogonal experiments for optimization of solid fermentation conditions

表9 正交試驗結果方差分析Table 9 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表9可知，在0.05的顯著性水平下，裝料量對MK產量結果影響顯著（P＜0.05），其他兩個因素對MK產量結果影響均不顯著。

2.6 基因表達

進行定量PCR（qPCR）測定所用引物見表10。ATF4、CHOP分別為活化轉錄因子4、CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白，屬于內質網應激通路。

表10 引物序列Table 10 Primers sequences

MK、功能紅曲米（FR）等干預物對肝L02細胞的基因表達的影響見圖1。由圖1可知，MK和功能紅曲米（FR）均具有明顯的降脂效果，且功能紅曲略優于MK（P＜0.05）。

圖1 基因定量PCR表達變化Fig.1 Expression levels of gene quantification PCR

3 結論

通過正交試驗設計，實現了功能紅曲固態發酵產MK工藝條件優化：高溫35℃持續5d，低溫22℃持續15d，裝料量360g/L；同時初步探討了MK降脂作用，發現功能紅曲與MK通過緩解內質網應激起降脂作用。

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