度他雄胺對人前列腺癌PC-3細胞移植裸鼠成瘤預防效應與機制研究*

周仕軼 李俊濤張蜀武

成都中醫藥大學臨床醫學院/附屬醫院（成都 611137）

度他雄胺對人前列腺癌PC-3細胞移植裸鼠成瘤預防效應與機制研究*

周仕軼 李俊濤**張蜀武

成都中醫藥大學臨床醫學院/附屬醫院（成都 611137）

目的探討新型5α還原酶抑制劑——度他雄胺對人前列腺癌PC-3細胞裸鼠移植瘤的成瘤預防效應與機制。方法選取BALB/C裸鼠30只，隨機平均分為度他雄胺組、非那雄胺對照組和陰性對照組，均采用皮下注射人前列腺癌PC-3細胞建立移植瘤模型，同時度他雄胺組裸鼠每日腹腔注射度他雄胺含藥血清，非那雄胺組每日腹腔注射非那雄胺含藥血清，陰性對照組每日腹腔注射非含藥血清。給藥30d內，觀察實驗期間各組動物移植瘤生長曲線，移植瘤倍增時間，成瘤百分率。30d后處死動物，免疫組化法結合圖像分析各組裸鼠瘤體ECM降解程度，RT-PCR法檢測細胞外基質-整合素（ECM-integrin）跨膜信號通路關鍵蛋白integrinβ1，β2和β6的表達情況。結果實驗期間各組裸鼠移植瘤成瘤率均為100%，移植瘤生長曲線近似，與陰性對照組相比，度他雄胺和非那雄胺組移植瘤成瘤平均潛伏期延長（P＜0.05），度他雄胺組腫瘤倍增時間比陰性對照組和非那雄胺組延長，差異具均統計學意義（P＜0.05）。免疫組化檢測度他雄胺組和非那雄胺組瘤體ECM較陰性對照組明顯降解，表現為纖維鏈接蛋白（FN）和膠原（CL）表達明顯降低（P＜0.01或P＜0.05），基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）表達明顯增強（P＜0.01或P＜0.05）；RT-PCR法檢測度他雄胺組瘤體細胞integrinβ1和β6表達較陰性對照組明顯降低（P＜0.01或P＜0.05），integrinβ1 表達較非那雄胺組降低（P＜0.05），結論 度他雄胺能通過降解人前列腺PC-3細胞裸鼠抑制瘤ECM，降低integrinβ1和β6表達，從而抑制決定前列腺癌細胞生長、增殖和轉移的關鍵信號通路-ECM-integrin信號通路，從而延長移植瘤成瘤和倍增時間，但不能有效抑制成瘤率，因此尚不能明確其具有預防前列腺癌的作用，同時也說明前列腺癌形成和生長機制具有多重復雜性。

度他雄胺; PC3細胞; 前列腺腫瘤; 小鼠,裸

前列腺癌（Prostate Cancer, PCa）是老年男性常見腫瘤，美國2013年癌癥統計數據表明該病預計發病率仍居所有腫瘤疾病的第一位，死亡率也僅次于肺癌位于腫瘤疾病第二位[1]，嚴重危害男性健康。在我國，PCa也是發病率和死亡率增長最快的腫瘤，并且由于早期診斷技術未能普及，形成了低于全球發病率的假象[2]，并呈現高MR/IR（死亡率/發病率）比的現象[3]。

目前，針對PCa的治療復雜多樣，療效隨病程進展而逐漸下降，因此對PCa預防，特別是化學（藥物）預防的研究成為了熱點。度他雄胺（Dutasteride）是新型5α還原酶抑制劑（5ARI），具有同時抑制5ARⅠ和5ARⅡ的雙重作用，臨床報道用于預防PCa有效，但同時存在增強Gleason高分級PCa發病風險的爭議。本研究利用體外細胞培養和裸鼠皮下注射移植瘤等方法，觀察度他雄胺對裸鼠移植瘤成瘤的預防效果，及其對PCa形成、增殖和轉移起關鍵作用的ECM-integrin（細胞外機制-整合素）跨膜信號通路的影響，探討其預防PCa的效應和機制。

材料和方法

一、實驗藥物及配制

度他雄胺軟膠囊，由葛蘭素史克公司生產，規格0.5mg/粒，國藥準字H20110205，生產批號35826003。將膠囊去殼，內含白色粉末溶于生理鹽水制成溶液。

非那雄胺片（Finasteride），由杭州默沙東制藥有限公司生產，規格5mg/粒，國藥準字J20090145，生產批號130321。將片劑研磨成極細粉末，溶于生理鹽水制成溶液。

二、細胞培養

人前列腺癌PC-3細胞，由中科院昆明細胞庫提供，該細胞株不具有可檢測的雄激素敏感性，為雄激素非依賴性細胞。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液置于37℃、5%CO2的孵化箱內培養、傳代，每周傳代3次，傳代比為1:3，直至細胞數量達到實驗要求。

二、實驗動物及造模

（一）含藥血清提取

成年雄性SD大鼠45只，2月齡，體質量200～250g，由成都中醫藥大學實驗動物中心提供（認證編號：川實動管質第9號）。大鼠隨機分成3組，每組15只。3組大鼠分別灌胃度他雄胺溶液0.083mg?kg-1?d-1（相當于成人日劑量的10倍），非那雄胺溶液0.83mg?kg-1?d-1（相當于成人日劑量10倍）和等容生理鹽水，連續5d。腹主動脈取血，分離足夠度他雄胺和非那雄胺含藥血清及非含藥血清。

（二）裸鼠及造模

雄性BALB/C裸小鼠30只，8～10周齡，體質量20～ 22g，提供方同上。按文獻報道造模方法[4]，待PC-3細胞處于對數生長期，且濃度達到2×107個/mL時收集細胞并制成混懸液，調節好細胞濃度為5×107個/mL 的PC- 3細胞共2.5mL，以1mL注射器抽取細胞懸液， 每只裸鼠接種0.2mL， 接種細胞量約為1×107個，接種部位為裸鼠頸背皮下， 接種前用碘復消毒裸鼠皮膚。

三、實驗分組和給藥

注射造模裸鼠隨機分為度他雄胺組、非那雄胺組和陰性對照組，每組30只。在注射后移植瘤生長期同時做腹腔注射給藥，度他雄胺組腹腔注射大鼠30%度他雄胺含藥血清0.2mL?kg-1?d-1；非那雄胺組腹腔注射大鼠30%非那雄胺含藥血清0.2mL?kg-1?d-1；陰性對照組腹腔注射30%大鼠無藥血清0.2mL?kg-1?d-1，連續30d。

四、移植瘤成瘤觀察

（一）移植瘤生長曲線觀測

細胞移植和給藥10d后，每3天測量1次腫瘤長徑（b），短徑（a），按公式V = 1/6（πab2）計算腫瘤體積，共觀察20d，并繪制生長曲線圖，并計算成瘤潛伏期。

（二）腫瘤體積倍增時間（TD）

TD = 0.1×t /（logDt-logDo）， Do為第一次測得的腫瘤直徑，Dt 為經過t時間后測得的腫瘤直徑。

成瘤率的計算：成瘤百分率= （接種成功只數/接種總數）×100%。30d后，處死裸鼠，分離頸部移植瘤，大體觀察移植瘤的形態、體積、顏色及與周圍組織的關系。

五、ECM降解觀察

纖維連接蛋白（FN）、羊多克隆抗體（goat polyclonal IgG）和基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）羊多克隆抗體（goat polyclonal IgG）均購自Santa Cruz Biochemistry公司。以上相應二抗及試劑盒購自北京中杉生物技術有限公司。將度他雄胺組、非那雄胺組和陰性對照組分離移植瘤組織進行病理切片，免疫組化染色，膠原（CL）用Masson染色，運用MIAS-2000型圖形圖像分析系統對染色結果進行分析，觀測各指標的面積、積分光密度和平均光密度。

六、RT-PCR法對ECM-integrin信號通路關鍵蛋白觀察

（一）細胞總RNA提取

提取各組移植瘤細胞，用Trizol法裂解細胞，按比例加入氯仿，離心管混勻。室溫靜止分層后，40℃ 1 200×g，離心15min。在離心管中按比例加入室溫下75%乙醇，7 500×g，離心5min，棄上清液。室溫下靜止5～ 15min，細胞RNA沉淀干燥，溶解后，-70℃保存。

（二）PCR基因表達產物擴增

1. 取5mL RNA樣本做凝膠電泳，以確定提取RNA的量是否達到反轉錄要求。

2. 將RNA反轉錄為cDNA，參照AMV Reverse Transcriptase（Ferment）操作程序進行RNA的反轉錄反應，各檢測基因引物序列與片段長度見表1。

表1 各引物序列與片段長度

3. PCR基因擴增，按反應體系加入相關試劑和引物，反復嘗試摸準PCR反應條件后，取PCR產物5μL 1%瓊脂糖凝膠電泳80V，100mA，30min。采用Greenview染色，用全自動凝膠成像儀成像，并分析結果，以β-actin為內參照標準進行半定量分析。分析系統測定各特異產物條帶和內參照的強度，計算特異擴增產物的相對量，計算公式為：特異擴增產物的相對量=特異條帶的強度/內參照的強度×100%。

七、統計學方法

所有資料均采用SPSS 19.0進行統計學處理，結果以均數±標準差（±s）表示。各組間比較采用單因素方差分析，其中方差齊者用LSD法，方差不齊者用Dunnett's檢驗。

結 果

一、度他雄胺對裸鼠移植瘤成瘤的影響

各組裸鼠移植瘤成瘤潛伏期和腫瘤倍增時間見表2。結果顯示：度他雄胺組和非那雄胺組成瘤潛伏期比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。這兩組與陰性對照組比較，均有效延長，差異均有統計學意義（P＜0.05）。度他雄胺組裸鼠腫瘤倍增時間較陰性對照組和非那雄胺組延長，差異均具統計學意義（P＜0.05)。最終各組裸鼠成瘤率均為100%。各組裸鼠移植瘤生長曲線近似，見圖1。經30d試驗后處死裸鼠，剝離移植瘤觀察各組移植瘤瘤體形態近似，包膜均完整，均無向周圍組織浸潤生長現象，各組瘤體體積比較無統計學差異，見表2。各組瘤體剖面觀察呈粉紅色，中間有部分壞死灶。各組瘤體分離細胞經染色鏡下觀察具有腫瘤細胞特征。

圖1 各組裸鼠移植瘤生長曲線圖

表2 各組裸鼠移植瘤平均成瘤潛伏期、腫瘤倍增時間和瘤體體積比較（±s）

表2 各組裸鼠移植瘤平均成瘤潛伏期、腫瘤倍增時間和瘤體體積比較（±s）

注：與陰性對照組相比,*P＜0.05; 與非那雄胺組比,△P＜0.05

組別 成瘤平均 腫瘤平均 30d腫瘤潛伏期(d) 倍增時間(d) 平均體積(mm3)陰性對照組 18±3.0 9±1.1 2339.5±233.7度他雄胺組 19±3.1*10±0.9*△2298.6±245.4非那雄胺組 19±3.7*9±1.3 2341.0±220.8

二、度他雄胺對裸鼠移植瘤ECM的降解作用

CL是ECM含量最多的成分，經Masson染色后呈藍紫色；FN能促進ECM各類成分的結合并沉積，經免疫組化染色后陽性表達呈黃褐色；MMP-2具有降解前兩者的作用，經免疫組化染色后陽性表達呈黃褐色。三者結合可作為觀測藥物對ECM降解作用的綜合指標，通過MIAS-2000圖像分析系統，可從面積、積分光密度和平均光密度3個指標來分析三者的表達量。結果與陰性對照組相比，度他雄胺和非那雄胺組能降低CL和FN的面積、積分和平均光密度，并增強MMP-2相關指標的作用（P＜0.01或P＜0.05），兩組間比較無統計學差異（P＞0.05），表明度他雄胺和非那雄胺均具有降解裸鼠移植瘤ECM的作用。各組CL、FN和MMP-2面積、積分和平均光密度比較見表3和圖2。

圖2 各組移植瘤CL、FN和MMP-2陽性表達

表3 各組CL、FN和MMP-2的面積，積分和平均光密度比較（±s）

表3 各組CL、FN和MMP-2的面積，積分和平均光密度比較（±s）

注：與陰性對照組相比，P＜0.05，P＜0.01

CL FN MMP-2組別 面積 積分光密度 平均光密度 面積 積分光密度 平均光密度 面積 積分光密度 平均光密度(μm2) (IU) (IU) (μm2) (IU) (IU) (μm2) (IU) (IU)陰性對照組 221.17±13.38 3347±223.6 78.66±14.06 142.34±16.09 876.21±93.44 81.22±9.11 3.05±0.42 24.65±0.32 6.87±0.56度他雄胺組 197.35±9.87**3059±151.7**67.04±13.58**136.67±11.47**853.23±93.19*70.69±9.03*3.66±0.40*29.77±0.37*7.25±0.50*非那雄胺組 199.82±9.36**3118±159.2**67.02±13.49**139.95±12.36*848.77±94.17*73.35±8.73*3.43±0.34**29.48±0.30*7.38±0.61****

三、度他雄胺對裸鼠移植瘤ECM-integrin信號通路的作用

度他雄胺在有效降解移植瘤ECM后，與陰性對照組比較，對integrinβ1和integrinβ6表達呈抑制作用（P＜0.01或P＜0.05），與非那雄胺組比較，對integrinβ1抑制作用更佳（P＜0.01）。各組對integrinβ1，integrinβ2和integrinβ6表達影響結果見表4和圖3至圖5。

表4 各組integrinβ1，integrinβ2和integrinβ6表達量比較（±s）

表4 各組integrinβ1，integrinβ2和integrinβ6表達量比較（±s）

組別 integrinβ1 integrinβ2 integrinβ6表達量 表達量 表達量陰性對照組 0.337±0.021 0.641±0.048 0.616±0.055度他雄胺組 0.055±0.006**△0.633±0.044 0.565±0.047*非那雄胺組 0.203±0.018**0.650±0.039 0.577±0.049*

注：與陰性對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與非那雄胺組相比,△P＜0.01

圖3 各組移植瘤細胞integrinβ1表達PCR擴增圖

圖4 各組移植瘤細胞integrinβ2表達PCR擴增圖

圖5 各組移植瘤細胞integrinβ6表達PCR擴增圖

討 論

一、實驗對象選擇

（一）實驗藥物選擇

度他雄胺是新型5ARI，具有同時抑制5ARⅠ和5ARⅡ的雙重作用，已由美國FDA批準上市，主要用于治療前列腺增生癥（BPH）和雄性脫發等病。目前度他雄胺用作藥物預防PCa的研究成為熱點，對諸如REDUCE實驗（度他雄胺降低前列腺癌發病風險實驗）等大規模臨床實驗的綜合分析表明，BPH病人長期持續服用度他雄胺可以降低低分級PCa的發病風險，并有助于治療性診斷高分級PCa，因此被視為PCa預防的里程碑[5]。循證醫學資料也表明，相比坦索羅辛對照組和安慰劑組，度他雄胺能有效降低BPH合并PCa高發病風險患者的PCa患病率（MHRR: 0.66, 95% CI 0.52-0.85）[6]；但也有資料顯示，度他雄胺可能會增加高分級PCa的發生風險[7]。目前，度他雄胺預防PCa的研究也主要見于上訴臨床研究，但預防機制實驗研究未能查見，尚屬研究空白。因此本研究選擇度他雄胺為研究對象，擬揭示其預防PCa的實驗效應和機制。

（二）對照藥物選擇

非那雄胺是5ARⅡ抑制劑，臨床用于治療BPH，與實驗藥物屬于同類藥物，但作用范圍不及度他雄胺。臨床PCPT（前列腺癌預防實驗）研究[8]和循證醫學資料均顯示[9]，非那雄胺具有降低PCa發病率的作用，與對照組相比，合并OR=0.68，降低發病風險32%。因此非那雄胺作為本研究的對照藥物，能同時探討并比較實驗和對照藥物預防PCa的效應和機制。

二、ECM-integrin信號通路

細胞外基質-整合素細胞生存通路（ECM-integrin cell survival pathway）是PCa細胞失巢凋亡調控的關鍵機制之一，它的激活能促使細胞在脫離與ECM黏附后繼續生存[10]，從而促成PCa的最終形成，生長，侵襲和轉移。ECM與上皮細胞的相互作用能介導integrin依賴性分子激活（其中integrinβ1, β2和β6最重要，被發現在PCa發生和轉移進程中明顯上調[11]），被激活的分子通過介導FAK（Focal adhesion kinase, 黏著斑激酶）激活，繼而激活Src基因族，Src再激活PI3K/Akt（磷脂酰肌醇3-蛋白激酶B）信號通路，促使細胞增殖和凋亡逃避，或通過介導ILK-1（Integrinlinked kinase1,整合素鏈接激酶1）激活，ILK1激活后可介導GSK3β（Glycogen synthase kinase3β，糖原合成激酶3β）激活并募集Snail基因族，然后通過級聯效應激活PI3K/Akt信號通路，最終促使細胞在脫離ECM后生存并再與其他ECM黏附，促使PCa的生成。通過前期研究，我們已經證實PI3K/Akt信號通路受到抑制，將會促使人前列腺癌DU-145細胞增殖抑制和凋亡[12]。因此，ECM-integrin信號通路是調控PCa生成和轉移的關鍵上游分子機制。通過前期研究，我們也證實了非那雄胺具有通過抑制CL和FN表達，增強MMP-2表達從而降解ECM的作用[13]。因此本研究正基于非那雄胺能降解ECM，從而推測其同類新型藥物度他雄胺也能降解ECM，兩種藥物降解ECM后導致ECM-integrin信號通路不能激活，其下游分子機制失效，從而使PCa不能形成、增殖、侵襲和轉移的假設而立論的。

三、問題與展望

通過本研究，我們揭示了度他雄胺能通過降解人前列腺PC-3細胞裸鼠抑制瘤ECM，降低integrinβ1，β2和β6表達，從而抑制決定前列腺癌細胞生長、增殖和轉移的關鍵信號通路——ECM-integrin信號通路的作用。但各組裸鼠移植瘤最終均能成瘤，度他雄胺僅表現為能延遲移植瘤平均成瘤時間和腫瘤倍增時間，因此尚不能說明其具有預防前列腺癌的作用，這與大多數臨床研究文獻的報道存在一定矛盾。同時，由于其能降解ECM，特別是MMP-2表達受到抑制后，會導致腫瘤細胞易于在瘤體中活動，而獲得侵襲和轉移的能力，這也印證了對其會增加高分級PCa發生的擔憂。本研究移植瘤并非位于實驗動物的前列腺，因此度他雄胺和非那雄胺降解ECM和調控ECM-integrin的作用是否充分發揮，也還難以完全闡明。

今后，還應進行大樣本和長期隨訪的臨床研究來充分揭示度他雄胺對PCa的發病風險的抑制作用。由于PCa的發生機制具有多樣復雜性，藥物預防PCa的效應和機制還應成為研究熱點，以便為藥物臨床應用提供理論支持和方法指導。

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（2014-02-28收稿）

Prevention effects dutasteride on human prostate cancer PC-3 cells transplanting tumors in nude miceand its mechanism

Zhou Shiyi, Li Juntao**, Zhang Shuwu Clinical Medical College of Chengdu University of TCM/Aff liated Hospital of Chengdu University of TCM, Chengdu 611137, China

ObjectiveTo investigate the prevention effects of new type 5α reductase inhibitor-dutasteride on human PC-3 cells transplanting tumors in nude mice and explore its mechanism.MethodsHuman prostate cancer cells PC-3 were transplanted subcutaneously around 30 nude mice’s necks to establish transplanting tumor models. Then 30 nude mice were divided randomly and evenly into the dutasteride group(treated with intraperitoneal injection of dutasteride serum), the fenasteride group(treated with intraperitoneal injection of fenasteride serum) and the control group (treated with intraperitoneal injection of no durg serum). The tumor growth curve, tumor double time and tumor formation rate were measured during 30 days administration . The immunochemistry and MIAS image analysis were applied to investigate ECM degradation and RT-PCR was applied to measure the expression of integrin β1, and β6 after 30 days of transplantation.Results The tumor growth curves of three groups were similar. Dutasteride could prolong tumor double time as compared with the other 2 groups but there was no statistical signif cance (P>0.05). Both dutasteride and fenasteride could degrade tumor ECM by inhibiting the expression of CL and FN (P<0.01 or P<0.05), and enhancing MMP-2 expression (P<0.01 or P<0.05) compared with the control group. Dutasteride could inhibit integrin β1 and β6 expression (P<0.01 or P<0.05) and had the inhibiting trend of integrin β2 (P>0.05) compared with the control group.ConclusionDutasteride can inhibit ECM-integrin signal pathway by degrading ECM and inhibiting the expression of integrinβ1 and β6. Even so, it can only prolong the tumor formation and double time but can not prevent the formation of human PC-3 transplanting tumor in nude mice. Thus the present data can not supportthat dutasteride has the prevention effect on PCa, but reflecting the complicatedprinciples of PCa formation.

Dutasteride; PC3 cells; prostatic neoplasms; mice, nude

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.06.003

R 737.25

資助: 四川省衛生廳2012年立項資助科研課題（編號：120466）**為在讀博士研究生