血小板活化因子和A23187對精子頂體反應的影響

黃千貽 李慕軍江 莉 吳惠梅

廣西醫科大學第一附屬醫院生殖中心（南寧 530021）

·研究簡報·

血小板活化因子和A23187對精子頂體反應的影響

黃千貽 李慕軍*江 莉 吳惠梅

廣西醫科大學第一附屬醫院生殖中心（南寧 530021）

頂體反應（AR）是精子受精過程中的一個必要過程。在IVF或體內自然受精過程中，精子的AR是由透明帶糖蛋白受體誘發的[1]，只有透明帶誘發的AR才具有重要生理意義。但是目前無法分離出足夠的此類物質以常規測定精子頂體功能并應用于診斷，所以需要研究天然AR激動劑的替代物及建立最佳誘導AR體系，這樣誘導的AR才更符合生理要求。已知大量的內源性因子可以調節精子生育的潛能，其中包括血小板活化因子（platelet-activating factor，PAF）。有研究表明，PAF除有血小板激活功能外，其還能誘導動物精子體外獲能和發生頂體反應[2,3]。本實驗采取鈣離子載體（A23187）誘導人精子AR作為陽性對照組，以探討PAF對人精子AR的影響，為尋求天然AR激動劑的替代物及建立最佳誘導AR體系提供有力的理論依據，同時為不育癥的診治開辟一條新的途徑。

材料方法

一、試劑準備

1. PAF貯存液：0.3mL PAF溶液稀釋于114mL氯仿和甲醇的混和液中（氯仿:甲醇為1:4），配成終濃度為10-5mol/L的溶液，分裝后儲存于-20℃備用。

2. FITC-PSA貯存液：2mgFITC-PSA溶于20mL PBS（pH值7.4），1mL分裝，4℃避光保存。

3. A23187：1mgA23187溶解于1mL DMSO中，配成終末濃度為1mg/mL溶液，少量分裝后-20℃避光保存備用，此過程避光操作。

4. 熒光DNA粘合染料（Hoechst33258，H258）：取1mg溶于50mL PBS（pH值7.4）中，配成終末濃度為100μg/mL的溶液，分裝后-20℃避光保存備用。

二、樣本和精液制備

32例為接受體外受精-胚胎移植（IVF-ET）治療患者，女方為繼發不孕患者，男方為健康且曾使女方懷孕患者，精液常規各項指標均在正常范圍（符合WHO人類精液分析標準2001年）。取卵日當天早上囑男方以手淫法獲取精液（禁欲2～7d），裝入無菌取精杯中，液化后進行精液常規分析。精液處理采用40%、80% percoll密度梯度離心法，三次離心后去部分表層，留至0.5mL精液，取部分上層液，加入ART-1020顯微鏡下調整密度2～5×106/mL至少2mL備用。將至少2mL已制備好的精子懸液放入37℃含有5%CO2恒溫培養箱繼續培育4h，使其獲能。

三、誘導頂體反應和評估頂體狀態

PAF組取10μl PAF貯存液置于1.5mL硅化管內，氮氣干化后放入37℃、5%CO2培養箱預平衡1h，然后加入500μl制備好的精子懸液，PAF終濃度為10-7mol/L[2]；陽性對照組加入相同的500μl精子懸液，同時加入2.6μl A23187溶液，使其終末濃度為10μmol/L；空白對照組加入含等量DMSO的溶液（DMSO濃度＜1%）。三組均放入37℃含有5%CO2恒溫培養箱培育15min后轉移至對應離心管內，加入H258溶液5μl，繼續培育5min。用0.9%生理鹽水150g離心10min洗滌2次。棄去上清液，取精子沉淀20μl進行FITC-PSA染色。將20μl精子沉淀制片后，室溫下避光自然干燥, 95%酒精固定30min，超純水沖洗15min，甩干。取1mL FITC-PSA貯存液加入1mLPBS液，配成終末濃度為50μg/mL，常溫下將固定好的精子涂片用FITC-PSA避光染色30min。12.5%戊二醛溶液終止AR。超純水沖洗10min，自然風干。滴加含0.22mol/L DABCO的甘油溶液作為熒光封固劑封片。4℃下避光短暫保存，采用病理圖像分析儀熒光顯微鏡（德國LEICA，DMR+Q550），100×油鏡觀察。每張精子涂片檢查四方和中央共5個區域，計數≥200個精子，計數發生AR的活精子數并換算成百分率。記錄，存圖。

四、結果分析

1. 頂體完整，活精子：Hoechst 33258-/PSA+ 頂體帽有黃綠色熒光而核區無藍光。

2. 頂體完整，死精：Hoechst 33258+/PSA+ 頂體帽有黃綠色熒光，核區有藍光。

3. 發生頂體反應，活精子： Hoechst33258-/ PSA+ Ⅰ型 頂體帽部分脫落，精子頭部帽狀球形黃綠色熒光呈不均勻，核區無藍光—表示剛發生AR不久，頂體內容物尚未完全丟失；Ⅱ型 頂體帽全部脫落，精子頭部帽狀球形下保留一明顯條帶狀（赤道板狀）黃綠色熒光染色區，核區無藍光—表示完全發生AR者；或Hoechst 33258-/PSA- Ⅲ型頂體區和頂體后區均無熒光，核區無藍光—表示全頂體破裂，是早已完成AR者。

4. 頂體缺失，死精：Hoechst 33258＋/PSA- 頂體帽無熒光，核區有藍光。

五、統計學分析

所有數據統計分析采用SPSS17.0統計軟件包，組內各AR%均呈近似正態分布，以均數±標準差（±s）表示，兩兩組間比較采用配對均數比較t檢驗，當P＜0 .05說明差異具有統計學意義。

結 果

PAF組人精子AR%（29.90±10.815）和A23187組人精子AR%（54.93±1.320）均明顯高于空白對照組的自發性AR%（13.54±7.820）；PAF組人精子AR%（29.90±10.815）低于A23187組人精子AR%（54.93± 1.320），差異均有統計學意義（P＜0.01）。 此外，根據世界衛生組織精液分析手冊（WHO，2001）的標準，鈣離子載體激發（ARIC）的實際AR為A23187組%AR減去空白對照組%AR，本實驗ARIC%AR為（41.39±15.15）%。根據手冊，ARIC%AR的正常值為15%，如＜10%為異常，10%～15%之間提示精子功能可能異常。本實驗結果大于15%，提示所取對象精子頂體功能正常。

討 論

本實驗通過PAF和A23187誘導人精子頂體反應，研究兩者對精子頂體反應的影響。為避免死精或退化頂體丟失造成AR的假相，因而檢測AR必須同時檢測是否為活精子。本實驗采用Hoechst33258聯合FITCPSA標記法[4]，對精子進行雙重染色剔除死精子對AR發生率的干擾，可以同時測得精子頂體狀態及是否是活精子。FITC受激發光（450nm～490nm）的照射而發出明亮的熒光（黃綠色），Hoechst33258受紫外光（280nm～360nm）照射發出藍光。

本實驗結果表明，PAF和A23187均能誘導人精子發生AR，但兩者誘導AR的強度不同，PAF組頂體反應率明顯低于A23187組，可能是A23187的作用超過了正常的生理反應。由于A23187一方面可使大量精子迅速致死，另一方面由于它具毒性，因此，A23187誘發AR主要用于科研。

迄今已知透明帶、透明帶溶解液或提純的透明帶分子組分ZP與獲能精子培養，均可誘導 AR。因為這類成分是天然物質，故通常認為這樣誘導的AR代表或接近于體內發生的自然AR。有研究表明活精子的AR%與精子的卵透明帶穿透率呈強正相關，透明帶誘發精子AR%已成為評價精子功能的一個可靠的指標[5,6]。但是一個存在的問題是無法獲得大量天然的人透明帶用于臨床不育診斷研究。因此，體外要準確評價人類精子AR功能，需要有合適的生理性誘導因子，這樣誘導AR才更接近生理性。國外采用完整人卵透明帶誘導精子AR，其發生率平均為45%[5]；國內有研究采用人透明帶糖蛋白誘導人精子， AR%為（32.45±6.92）%[7]；采用可溶性人ZP，誘導精子AR%約為30%[8]；而采用與人卵透明帶有交叉反應性的小鼠，ZP誘導人精子AR，其發生率只有22%～30%[9,10]。本研究發現PAF誘導的精子AR%雖不及A23187高，但PAF誘導的AR%結果（29.90± 10.815）%與上述學者用天然物質誘導精子AR%的結果接近[10,11]。提示PAF誘導人精子的AR可能更具有實用價值，其是否可為人類AR的研究和AR缺陷綜合征的臨床診斷提供有利的手段，臨床上幫助不孕夫婦選擇合適的助孕方式并預測IVF受精失敗，仍有待通過進一步研究PAF誘導的人精子AR與透明帶誘導的人精子AR的關系來證實。

目前PAF對人精子AR的確切作用機制尚不清楚。多位學者在精子尾部頸段和中段發現了PAF受體（PAF receptor，PAFR）濃度最高[12]。頸段是近端中心粒的位置，PAF可能對中心粒完整的精子有刺激影響，而精子尾部中段既是線粒體場所也是精子活動的關鍵部位。胞內Ca2+濃度增加是誘導精子獲能和AR的必須條件。推測PAF是通過受體介導調控胞內Ca2+濃度影響精子活力和受精潛力，提高成功受精率及胚胎發育率。近年來有學者在豬精子上檢測到PAF受體，同時認為鈣離子誘導的頂體反應是通過PAF刺激來調節的[13]。PAF對精子功能的影響是受體介導的屬于IP3、二酰甘油（diacylglycerol，DAG）、Ca2+的信使系統[14]：PAF通過與細胞上特異性G蛋白受體結合后激活磷酸肌醇特異性的磷脂酶C（phospholipase C，PLC），催化質膜上磷脂酰肌醇（phosphatidyl inosito，PI）水解，產生兩個第二信使——IP3和DAG，IP3通過兩條途徑引起胞內Ca2+濃度的升高：（1）細胞線粒體內儲存Ca2+的釋放；（2）細胞外Ca2+通過通道向細胞內轉運。繼之激活蛋白激酶C（protein kinase，PKC），催化靶蛋白磷酸化而發揮生物學效應[15]。Sengoku等[16]研究發現，PKA、PKC、PTK的抑制劑能降低PAF誘導的AR%，這就提示這三者信號途徑的轉導可能參與調節PAF誘導AR。

本研究除了發現A23187誘導的精子AR%明顯高于PAF外，還發現了A23187誘導AR精子類型主要是Ⅱ型，屬完全AR，說明誘導AR時間快（見圖1）；而PAF誘導AR精子類型主要屬于Ⅰ型，屬部分AR（見圖2）。主要原因可能與兩者誘導AR機制不同有關。A23187作為親脂性Ca2+載體，通過Ca2+和H+交換，使胞外Ca2+大量流入細胞內，促進cAMP產生，進而激活了cAMP-PKA系統，最終使一些蛋白質磷酸化，調節了精子質膜融合，同時鈣離子啟動細胞骨架系統，從而誘導出類似胞吐的AR。

圖1 A23187 組(Ⅱ型為主)

圖2 PAF 組(Ⅰ型為主)

綜上所述，A23187和PAF均可用于檢測獲能精子發生AR的能力。在相同的獲能及誘導時間下，PAF誘導的AR與A23187誘導的AR有顯著性差異，從而也說明了PAF和A23187誘導的AR不同。PAF作為一個內源性因子，其誘導人精子AR的能力可能更接近于生理透明帶誘導的能力，推測其能更真實反映精子AR的情況。

精子; 血小板活化因子; 頂體反應

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（2013-11-11收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.06.017

Q545; R321.1

*通訊作者, E-mail: lmj1699@vip.163.com