NaCl脅迫對椒樣薄荷光合作用和PSII光化學活性的影響

李哲，吳曉青，趙曉燕，魏艷麗，李紀順，楊合同，2*

(1.山東省科學院生物技術研究中心，山東 濟南 250014;2.山東理工大學生命科學學院，山東 淄博 250049)

土壤鹽漬化是影響植物生長的主要逆境因素之一［1］。NaCl是鹽漬化土壤中最主要的成分，對植物造成的傷害是多方面的。NaCl脅迫下，植物會出現營養失衡和滲透功能受損，活性氧過量產生導致膜完整性的破壞，進而引起光合電子傳遞系統失活、激素平衡破壞、生物量積累下降、蛋白質變性、核酸斷裂甚至細胞死亡［2］。光合作用決定著植物的生長發育和產量［3］，NaCl脅迫對植物光合特性的影響程度決定著植物的抗鹽能力和產量水平，可用作判斷植物生長和抗逆性強弱的指標［4－5］。光合作用通過兩個光系統 (PSI和PSII)將光能轉化為化學能，其中PSII被認為對NaCl脅迫尤其敏感，在植物響應NaCl脅迫的過程中發揮重要作用［3］。因此，許多學者圍繞NaCl脅迫對不同植物品種、植物組織PSII光化學活性的影響進行了廣泛探討［3，5－6］。

椒樣薄荷(Mentha piperita L.)是唇形科薄荷屬多年生草本植物，是天然香料，香氣純正、清爽宜人，廣泛用于日用化妝品、醫藥和糖果食品，具有巨大的經濟價值［7－8］。本實驗室在鹽漬化土壤經多年馴化篩選出了抗鹽椒樣薄荷品系——科院一號，適合在黃河三角洲地區鹽漬土壤上大規模推廣種植。課題組還首次開展了椒樣薄荷響應NaCl脅迫的生理特性的研究，發現它能夠耐受0.8%的NaCl脅迫，在該濃度下，椒樣薄荷植株能正常生長，并維持較高的含水量、較低的滲透勢、較低的電導率和Na+含量，但在遭受更高的NaCl脅迫時會受到一定程度的傷害［9］。

目前國內外對椒樣薄荷的研究與開發主要聚焦于精油組分的分析和提取，對其耐鹽特性研究較少，對NaCl脅迫下椒樣薄荷光合系統活性變化的研究更是尚未開展。本試驗以抗鹽椒樣薄荷品系為試材，對不同濃度NaCl脅迫下椒樣薄荷光合作用和PSII光化學活性的變化進行了研究，有助于深入了解椒樣薄荷的耐鹽機制，為其栽培管理、耐鹽品種的選育及耐鹽脅迫的人工調控提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

實驗所用椒樣薄荷(Mentha piperita L.)為本實驗室在鹽漬化土壤多年馴化篩選出的抗鹽品系(科院一號)。在人工氣候室內于光暗周期為10 h/14 h，晝夜溫度為26/20℃，空氣相對濕度為50% ～70%的條件下，大量培養椒樣薄荷植株，選取生長期(10葉期)一致的植株進行實驗。

實驗中所用的主要儀器有葉片面積測量儀 (LI-3100C，LI-COR，USA)，光合速率測定儀 (LI-6400;LICOR，USA)，葉綠素熒光儀 (PAM MINI，德國 Walz)，酶標儀 (Infinite 200，瑞士 Tecan)和電子天平(FA1004N，上海精密科學儀器有限公司)。

1.2 實驗處理

取普通耕作土和營養基質按1:1比例混合，混勻過篩后裝于塑料盆中。選取生長良好、大小一致(10葉期)的椒樣薄荷植株，移于塑料盆(每盆3株)中。培養7d后，分別以含有不同濃度NaCl(濃度分別為0、100、150、200mmol/L)的Hoagland溶液處理12 d，每個處理設5次重復。為了避免鹽激作用對植株的影響，采用每12 h遞增50mmol/L，直至達到最終NaCl濃度。每天用相應的NaCl溶液澆灌一次，澆灌量為土壤持水量的2倍，約2/3的溶液流出，從而將以前的積余鹽沖洗掉，以保持NaCl濃度恒定。

1.3 椒樣薄荷植株生長狀況的測定

分別取經不同濃度NaCl處理后的3株椒樣薄荷植株的地上部，利用電子天秤稱量鮮重。然后選取3株椒樣薄荷的葉片(從下往上數第3對葉)，利用葉片面積測量儀來測定葉片面積。

1.4 凈光合速率(Pn)、光合電子傳遞速率(ETR)和葉綠素含量的測量

分別取經不同濃度NaCl處理后的椒樣薄荷葉片(從下往上數第3對葉)，用便攜式光合速率測定儀來測量椒樣薄荷葉片的凈光合速率(Pn)和光合電子傳遞速率(ETR)［10］。LI-6400裝有6400-15葉室(直徑1.0 cm)，使用人工光源，光照強度為20000 Lx的飽和光。內置CO2注入系統，控制葉室CO2濃度為500mg/m3。總葉綠素含量用95%(V/V)乙醇提取，分光光度計法測定［6］。

1.5 葉綠素熒光參數的檢測

采用葉綠素熒光儀測定不同實驗組椒樣薄荷成熟葉片的葉綠素熒光參數。測定前，將葉片放置到暗適應夾中適應25～30min。測定時，將葉片放置到樣品室，打開檢測光，測定初始熒光;然后照射飽和脈沖光，每2.5 s一個脈沖，成像并測定反映PSII光化學活性的熒光參數:PSII最大光化學量子產量(Fv/Fm)、PSII有效光化學量子產量(Y(II))、光化學淬滅系數(qP)和可變熒光(Fv)［10］。

1.6 數據處理

數據均用SPSS和Origin統計軟件進行分析和制圖，計算各處理性狀的平均數、標準差，并進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 NaCl脅迫對椒樣薄荷生長狀況和生物量的影響

在100和150mmol/L NaCl處理下，與對照相比，椒樣薄荷的生長表型、鮮重以及葉片面積沒有受到明顯的影響，而在200mmol/L NaCl處理下，其生長表型、鮮重以及葉片面積均呈現出顯著的抑制和下降 (圖1～3)。200mmol/L NaCl處理12 d后，椒樣薄荷鮮重以及葉片面積的下降與同期對照相比十分顯著 (P＜0.05)，分別降至了同期對照的 56.63% 和63.62%(圖2～3)。

圖1 不同濃度NaCl脅迫對椒樣薄荷生長狀況的影響Fig.1 Impacts of different concentrations of NaCl stress on the growth condition of peppermint.

圖2 不同濃度NaCl脅迫對椒樣薄荷鮮重的影響Fig.2 Impacts of different concentrations of NaCl stress on the fresh weight of peppermint

圖3 不同濃度NaCl脅迫對椒樣薄荷葉片面積的影響Fig.3 Impacts of different concentrations of NaCl stress on the leaf area of peppermint

2.2 NaCl脅迫對椒樣薄荷Pn、ETR和葉綠素含量的影響

如圖4～5所示，在100和150mmol/L NaCl處理下，與對照相比，椒樣薄荷葉片的凈光合速率和光合電子傳遞速率值略有波動，但沒有受到明顯的影響，差異未達到顯著水平。而在200mmol/L NaCl處理下，Pn和ETR隨處理時間的延長有所下降 (P＜0.05)。200mmol/L NaCl處理6 d后，Pn和ETR分別降至了同期對照的66.67%和62.22%，而在200mmol/L NaCl處理12 d后，椒樣薄荷葉片Pn和ETR的下降與同期對照相比更加明顯，分別降至了同期對照的34.29%和38.11%(圖4～5)。葉綠素含量檢測的實驗顯示，在100和150mmol/L NaCl處理12 d后，與同期對照相比，葉綠素含量沒有受到明顯的影響，差異未達到顯著水平。而在200mmol/L NaCl處理12 d后，葉綠素含量明顯下降，降至了同期對照的56.69%(圖6)。

圖4 不同濃度NaCl脅迫對椒樣薄荷葉片Pn的影響Fig.4 Impacts of different concentrations of NaCl stress on Pn value of peppermint leaf

圖5 不同濃度NaCl脅迫對椒樣薄荷葉片ETR的影響。Fig.5 Impacts of different concentrations NaCl stress on ETR value of peppermint leaf

圖6 不同濃度NaCl脅迫對椒樣薄荷葉片總葉綠素含量的影響Fig.6 Impacts of different concentrations of NaCl stress on the totalchlorophyllcontentof peppermint leaf

圖7 不同濃度NaCl脅迫下椒樣薄荷葉片葉綠素熒光參數的成像Fig.7 Image of chlorophyll fluorescence parameters of peppermint leaf for different concentrations of NaCl stress

2.3 NaCl脅迫對椒樣薄荷葉片PSII光化學活性的影響

為了進一步驗證NaCl脅迫對椒樣薄荷光合系統的損傷機制，我們利用葉綠素熒光成像技術檢測了NaCl脅迫下PSII光化學活性的變化。熒光參數Fv/Fm反映了PSII的最大量子產量，Y(II)則反映了PSII的有效量子產量，它們都能夠反映PSII的光化學效率及活性［11］。葉綠素熒光成像及定量分析的實驗結果顯示，在100和150mmol/L NaCl處理下，與對照相比，椒樣薄荷葉片的Fv/Fm和Y(II)值沒有受到明顯的影響，差異未達到顯著水平(圖7、圖8A、B);而在200mmol/L NaCl處理下，其Fv/Fm和Y(II)值明顯下降，而且這個下降過程依賴于NaCl的處理濃度和處理時間 (圖7、圖8A、B)。200mmol/L NaCl處理6 d后，與同期對照相比，Fv/Fm和Y(II)值分別下降了25.38%和29.88%，而在200mmol/L NaCl處理12 d后，椒樣薄荷Fv/Fm和Y(II)值的下降與同期對照相比更加明顯，分別下降了38.5%和46.6%(圖8A、B)。

圖8 不同濃度NaCl脅迫下椒樣薄荷葉片葉綠素熒光參數的定量分析Fig.8 Quantitative analysis of chlorophyll fluorescence parameters of peppermint leaf for different concentrations of NaCl stress

2.4 NaCl脅迫對椒樣薄荷PSII中QA到QB之間電子傳遞的影響

在PSII復合體中，QAFe2+QB復合體是PSII的電子傳遞終端受體，QA到QB之間的電子傳遞依賴于Fe2+的活性和作用，它們之間的電子線性傳遞是光合電子傳遞鏈的重要組成部分，QA到QB之間的電子傳遞是PSII中敏感的易損傷靶點［3，10－11］。因此，檢測能夠反映QA到QB之間電子傳遞的葉綠素熒光參數qP和Fv的變化。穩態的光化學淬滅系數qP和可變熒光參數Fv的大小和強度都能夠反映還原態QA－的含量。qP的值越低，表明 QA－的含量越高［12］;Fv的值越高，表明 QA－的含量越高［13－14］。實驗結果顯示:在100mmol/L和150mmol/L NaCl處理下，與對照相比，椒樣薄荷葉片qP和Fv值沒有受到明顯的影響，差異未達到顯著水平 (圖7，圖8C、D);而在200mmol/L NaCl處理下，qP值明顯的降低 (圖7，圖8C)，而Fv值明顯的升高 (圖7，圖8D)，差異均達到了顯著水平，表明了還原態QA－含量的增加，說明QA到QB之間電子傳遞受到了阻斷。

3 結論

我們利用光合作用測定儀和葉綠素熒光儀研究了不同濃度NaCl脅迫對椒樣薄荷光合作用和PSII光化學活性的影響，得出以下結論:

(1)植物生長狀態是植物對NaCl脅迫反應的綜合體現，是植物耐鹽性的直接指標。在NaCl脅迫下，椒樣薄荷的生長和生物量呈現出了濃度依賴性的變化。在100和150mmol/L NaCl處理時，椒樣薄荷能保持正常的生長狀況，維持正常的鮮重以及葉片面積，但在200mmol/L NaCl處理下，其生長受到了明顯的抑制，對椒樣薄荷植株造成了一定程度的傷害，這與椒樣薄荷植株在高濃度NaCl處理后萎蔫的表型是一致的。

(2)NaCl脅迫對植物生長和代謝的影響是多方面的，尤以對光合作用的影響最為突出。100和150mmol/L的NaCl處理并未對椒樣薄荷葉片的凈光合速率Pn、光合電子傳遞速率ETR以及葉綠素含量產生明顯的影響，而在200mmol/L NaCl處理下，Pn、ETR和葉綠素含量均顯著的下降。之前的研究表明，在低濃度NaCl處理過程中，椒樣薄荷葉片中Na+含量變化不明顯，而高濃度NaCl脅迫下椒樣薄荷葉片中Na+含量明顯增加。由此推測，200mmol/L NaCl引起的光合損傷可能是由于高NaCl脅迫導致椒樣薄荷葉片細胞中Na+的大量累積，引起了葉片光合器官的損傷，造成葉綠素含量降低和葉肉細胞光合活性下降。

(3)PSII是光合系統中最敏感的組分，在植物光合系統對環境脅迫的應激中起著重要的作用，QA到QB之間的電子傳遞是PSII中敏感的易損傷靶點。NaCl脅迫下，植物進行光合作用受到傷害的最初部位是與PSII緊密聯系的。100和150mmol/L的NaCl處理對椒樣薄荷PSII活性沒有顯著影響。而200mmol/L NaCl脅迫顯著降低了Fv/Fm和Y(II)值，抑制了QA到QB之間的電子傳遞，導致PSII電子傳遞鏈的阻斷，使椒樣薄荷葉片發生了光抑制。

綜上所述，在100和150mmol/L NaCl脅迫下，椒樣薄荷能夠正常生長，光合活性以及PSII光化學活性沒有受到明顯的影響。隨著NaCl處理濃度的提高，200mmol/L NaCl脅迫抑制了PSII受體側QA到QB之間的電子傳遞活性，阻斷了光合電子傳遞鏈，造成了椒樣薄荷葉片光合活性和PSII光化學活性的顯著下降。本實驗研究了不同濃度NaCl脅迫下抗鹽椒樣薄荷品系光合作用和PSII光化學活性的變化，這有助于深入了解椒樣薄荷的耐鹽機制，為其栽培管理、耐鹽品種的馴化選育及耐鹽脅迫的人工調控提供理論基礎。

［1］ZHU J K.Plant salt tolerance［J］.Trends in Plant Science，2001，6(2):66－71.

［2］KATSUHARA M，KAWASAKI T.Salt stress induced nuclear and DNA degradation in meristematic cells of barley roots［J］.Plant＆ Cell Physiology，1996，37(2):169－173.

［3］BAKER N R.A possible role for photosystem II in environmental perturbations of photosynthesis［J］.Physiologia Plantarum，1991，81(4):563－570.

［4］LIU J，SHI D C.Photosynthesis，chlorophyll fluorescence，inorganic ion and organic acid accumulations of sunflower in responses to salt and salt-alkaline mixed stress［J］.Photosynthetica，2010，48(1):127 －134.

［5］MURATA N，TAKAHASHI S，NISHIYAMA Y，et al.Photoinhibition of photosystem II under environmental stress［J］.Biochimica et Biophysica Acta，2007，1767(6):414 －421.

［6］QIU N W，LU Q T，LU C M.Photosynthesis，photosystem II efficiency and the xanthophyll cycle in the salt-adapted halophyte Atriplex centralasiatica［J］.New Phytologist，2003，159(2):479 －486.

［7］陳小軍.椒樣薄荷高產栽培技術［J］.新疆中草藥，2008(7):72－73.

［8］姜殿勤，姜濱，張儉衛.野薄荷實用價值及人工栽培［J］.特種經濟動植物，2008(1):36－37.

［9］張俠，宋莉璐，等.椒樣薄荷對NaCl脅迫的生理響應［J］.安徽農業科學，2009，37(13):5967－5969.

［10］LI Z，XING F Q，XING D.Characterization of target site of aluminum phytotoxicity in photosynthetic electron transport by fluorescence techniques in tobacco leaves［J］.Plant＆ Cell Physiology，2012，53(7):1259 －1309.

［11］WODALA B，DEAK Z，VASS I，et al.In vivo target sites of nitric oxide in photosynthetic electron transport as studied by chlorophyll fluorescence in pea leaves［J］.Plant Physiology，2008，146(4):1920 －1927.

［12］APEL K，HIRT H.Reactive oxygen species:metabolism，oxidative stress，and signal transduction［J］.Annual Review of Plant Biology，2004，55:373－399.

［13］張雷明，上官周平，毛明策，等.長期施氮對旱地小麥灌漿期葉綠素熒光參數的影響［J］.應用生態學報，2003，14(5):695－698.

［14］HUANG H，LIU X Q，QU C X，et al.Influences of calcium deficiency and cerium on the conversion efficiency of light energy of spinach［J］.Biometals，2008，21(5):553－561.