劑量敏感的性別反轉先天性腎上腺發育不良基因1與雄激素受體相互作用的研究*

楊麗華 李俞池 王旭亮 石 敏 江智茂 桂耀庭

北京大學深圳醫院男性生殖與遺傳重點實驗室（深圳 518036）

·論 著·

劑量敏感的性別反轉先天性腎上腺發育不良基因1與雄激素受體相互作用的研究*

楊麗華 李俞池 王旭亮 石 敏 江智茂 桂耀庭**

北京大學深圳醫院男性生殖與遺傳重點實驗室（深圳 518036）

目的劑量敏感的性別反轉-先天性腎上腺發育不良基因1（dosage-sensitive sex reversal, adrenal hypoplasia critical region, on chromosome X, gene 1, DAX1）和雄激素受體（androgen receptor, AR）在男性生殖系統中均發揮著不可替代的作用，以往研究證明二者之間存在某些聯系，本實驗主要檢測DAX-1和AR蛋白在細胞內的相互作用情況。方法構建人的帶HA多肽標簽的DAX-1真核表達載體, 以脂質體方式將該質粒和雄激素受體真核表達質粒共轉染至非洲綠猴腎成纖維細胞（COS-7）中，轉染48h后收集細胞提取總蛋白，利用免疫共沉淀技術檢測DAX-1和AR蛋白在細胞內的相互作用。結果成功構建了人DAX-1真核表達載體；免疫共沉淀實驗結果顯示DAX-1和AR蛋白在COS-7細胞內可以相互作用。結論DAX-1與AR蛋白在細胞內可能存在相互作用，為后續研究DAX-1功能、突變致病及DAX-1與AR的作用機制奠定基礎。

基因, X連鎖; 受體,雄激素; 男性泌尿生殖系統疾病

Key woorrddssGenes, X-Linked; receptors, androgen; male urogenital diseases

劑量敏感的性別反轉-先天性腎上腺發育不良基因1（dosage-sensitive sex reversal, adrenal hypoplasia critical region, on chromosome X, gene 1, DAX1）是轉錄因子核受體家族的成員，由470個氨基酸組成，主要在哺乳動物的生殖系統中表達，如睪丸、卵巢、下丘腦、垂體、腎上腺等[1]。DAX-1 基因敲除的雄性小鼠表現為性腺機能減退、睪丸發育異常、生精障礙等[2]。已有研究證明先天性腎上腺發育不全（adrenal hypoplasia congenital, AHC）和促性腺激素分泌不足的性腺機能減退（hypogonadotropic hypogonadism, HHG）的發病與DAX-1突變有關[3]。雄激素受體（androgen receptor, AR）也是核受體家族中的一員，是一種配體依賴的反式轉錄調節蛋白。在細胞質內，AR與雄激素結合形成同源二聚體，進入胞核與靶基因的雄激素反應元件（ARE）結合調控下游基因表達[4]。AR 基因突變可使其喪失與雄激素的結合能力，導致男性不育或雄激素不敏感綜合征[5-7]。DAX-1和AR是兩個緊密相關的基因，兩者均位于X染色體上，且具有相似的表達水平，它們編碼的同源蛋白均有一個DNA結合區域。因此，我們推斷DAX-1和AR蛋白在細胞內可能存在相互作用。本研究擬構建人DAX-1 的真核表達載體，并與雄激素受體AR共轉染至COS-7細胞內，使用Co-IP技術和Western blot技術檢測兩者間是否存在相互作用，從而為后續研究 DAX-1功能、突變致病及DAX-1與AR的作用機制奠定基礎。

材料與方法

一、材料

非洲綠猴腎成纖維細胞COS-7購自美國菌種保藏中心（ATCC），人睪丸組織的RNA、高保真DNA聚合酶購自Takara公司，反轉錄試劑盒購自Fermentas公司，限制性內切酶購自NEB公司，質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、柱回收試劑盒購自Omega公司，引物合成及DNA測序于上海英濰捷基貿易有限公司完成，脂質體 LipofectamineTM2000購自Invitrogen 公司，人的AR真核表達載體由美國喬治惠普癌癥研究中心張傳祥教授惠贈,哺乳動物蛋白提取試劑盒購自Qiagene公司，AR的抗體購自Abcam公司，HA的抗體購自sigma公司，ProteinA/G珠子購自Millipore公司，DMEM 培養液、胎牛血清（FBS）購自美國 Gibco 公司，培養皿、培養板、移液管等耗材均購于Corning公司。

二、方法

（一）人DAX-1基因cDNA編碼區全長序列的獲取

根據 Gene bank 中 DAX-1 的序列用 Prime premier 5.0 軟件設計引物。DAX-1 引物序列∶上游5， CCCAAGCTTATGGCGGGCGAGAAC 3，下游5，CGCGGATCCCGTATCTTTGTACAG 3，分別在上游和下游引物的5，端加上HindⅢ和BamH1酶切位點。將人睪丸組織RNA逆轉錄合成cDNA，方法參照Fermentas反轉錄試劑盒說明書。以cDNA為模板進行PCR反應，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 產物大小。

（二）DAX-1真核表達載體的構建

用膠回收試劑盒回收擴增的PCR產物，用HindⅢ-HF和BamH1-HF分別雙酶切PCR產物和帶HA多肽標簽的pcDNA3.1(+)，37℃ 4h，對酶切后的產物分別進行柱回收和膠回收，T4 DNA連接酶連接回收后產物，連接體系： pcDNA3.1(+)-3' HA為2μl；回收的DNA片段為6μl；T4 Ligase為1μl；10× Ligation Buffer為1μl，16℃ 8h，取連接產物5ul加入到50ulDH5a感受態細胞中，置于冰上30min，42℃熱擊45s，冰上放置2min，加入600μl不含抗生素的LB培養液，37℃搖床培養60min，取200μl涂板(含100μg/mL氨芐青霉素的培養板)，放37℃培養過夜。挑克隆進行菌液PCR驗證，取陽性克隆送測序。

（三）細胞培養與轉染

用含有10%胎牛血清的DMEM完全培養基培養COS-7細胞，放置于37℃、5%CO2的培養箱中，按照無菌操作臺內的常規細胞培養方法培養。將處于對數生長期的COS-7 細胞以 3×105/孔密度接種于6孔培養板，待第2天細胞貼壁后，根據轉染試劑LipofectamineTM 2000的轉染步驟，將重組質粒pcDNA3.1(+)-3' HA-DAX1（實驗組，2μg）和pcDNA3.1(+)-3，HA空載（對照組，2μg）與hAR的表達載體（2μg）分別共轉染到COS-7細胞。

（四）細胞總蛋白的提取

轉染48 h后吸棄培養基，根據Qiagene公司的哺乳動物蛋白提取試劑盒的提取步驟用1×PBS溶液洗滌2次，加入1ml預冷的PBS用細胞刮輕輕刮下，轉移到1.5ml的Ep管，450×g，4℃離心5min，棄掉上清置于冰上，用100μl Lysis Buffer（含0.1U Benzonase Nuclease,1μl 100×Protease Inhibitor）重懸沉淀，4℃旋轉5min后，14 000×g，4℃離心10min，將上清轉移至新的離心管中。

（五）免疫共沉淀

將實驗組與對照組提取的蛋白平均分成4分，其中一份作為Input樣品，加入6.25μl的 5×SDS Loading Buffer（含5%1 mM DTT），混勻后98℃處理10 min，-80℃保存。余下3份上清液均加入475μl的Lysis Buffer，補充至每管總體積為500μl，之后分別加入2μg AR抗體，2μg HA抗體，2ug IgG；4℃旋轉1h；每管加入20μl ProteinA/G，4℃旋轉過夜。12 000×g，4℃瞬時離心20s，棄上清；加入600μl Lysis Buffer重懸，12 000×g，4℃離心1min；洗滌Beads，共洗滌3次，棄上清；向Beads中加入15μl的Lysis Buffer和等體積2XSDS上樣緩沖液，混勻后98℃處理10 m in。制備SDS聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣量15μl，常規電泳、轉膜、封閉，加入一抗（鼠抗人HA 和兔抗人AR單克隆抗體，1∶2000稀釋），4℃過夜孵育及相應的二抗（1∶10000稀釋）室溫孵育1 h, ECL 發光液處理后暗室內曝光膠片，于室溫下自然風干，掃描儀掃描結果保存。

結 果

一、PPCCRR法獲得DDAAXX--11基因

利用PCR法，成功獲取了約1413 bp的目的片段（圖1）。

圖1 DAX-1基因的PCR擴增結果

二、重組載體的鑒定

1%瓊脂糖凝膠電泳酶切結果（圖2）顯示，近1413bp處的條帶為酶切后的目的片段，測序結果也顯示該片段為DAX1編碼基因，表明pcDNA3.1(+)-3，HA-DAX1構建成功。實驗重復3次，結果均一致。

圖2 重組質粒pcDNA3.1(+)-3，HA-DAX1雙酶切結果

三、蛋白質CCoo--IIPP及Western BBlloott檢測結果

COS-7細胞中分別共轉入hAR和pcDNA3.1(+)-3，H A-D A X 1表達質粒（實驗組）以及h A R和pcDNA3.1(+)-3，HA空載（對照組），轉染48 h后收集細胞提取總蛋白，做anti-AR和anti-HA的Co-IP以及anti-AR和anti-HA的Western Blot檢測蛋白的相互作用和表達情況，結果顯示DAX-1和AR蛋白在細胞內可能存在相互作用（圖3）。

圖3 Co-IP及Western Blot檢測細胞內DAX-1和AR的相互作用

討 論

全球約有10%～15%的育齡夫婦面臨不能生育的問題，其中一半是由于男性不育。男性不育發病因素具有復雜性和多樣性的特點，包括疾病，營養不良，內分泌紊亂，基因缺陷和環境因素等[8]，其具體發病機制尚不明確，但從家族病例報道和小鼠模型的研究成果中可以推斷遺傳因素起了很大作用[9]。據估計，大約有2 000個不同的基因與男性生育有關[10]。大多數基因突變可使青春期發育受損，隨后由于下丘腦-垂體對性腺或其基因有重要促進作用的因子缺乏，最終引起男性不育。DAX-1和AR即是屬于下丘腦-垂體-性腺軸上的兩個基因，兩者均位于X染色體上，凡影響功能的基因突變均可引起表型的變化。據報道，DAX-1和AR是在男性人群中檢測到的自然突變率最高的兩個基因[11]。我們推測，DAX-1與AR蛋白在細胞內可能存在相互作用。

人類DAX-1基因位于X染色體p21，于1994年克隆成功[12]。該基因編碼的蛋白由470個氨基酸組成，是核受體家族的成員，DAX-1蛋白作為一種轉錄因子對垂體促性腺細胞和腎上腺皮質的發育起非常重要的作用。已有研究證明AHC和 HHG的發病與DAX-1突變有關[3]。由于DAX-1 基因位于Xp上的DSS區，當該區雙拷貝時常伴有46，XY男性的性反轉（女性化），所以起初DAX-1被認為是卵巢決定基因。但是，隨后的條件敲除研究結果表明它在調節精子發生中起重要作用，敲除后的雄性小鼠表現為性腺機能減退、睪丸發育異常、生精障礙等[2]。AR是迄今研究最多的與男性不育有關的基因之一，在哺乳動物精子生成中發揮著重要作用。其編碼的蛋白含有氨基端的DNA結合域和碳端的雄激素結合域。46，XY男性由于AR突變可引起完全性雄激素不敏感綜合征(CAIS),表現為女性的原發性閉經[5-7]。AR敲除的小鼠同樣表現出雄激素不敏感及睪丸下降不全癥狀，這類小鼠生精受阻,精原細胞大量死亡導致不育，且該癥狀不能被雄激素藥物補救[13]。

本研究結果顯示DAX-1和AR蛋白在細胞內可以相互作用，由于兩者在男性生殖系統中均有舉足輕重的地位，由此我們推測，DAX-1與AR蛋白相互作用的改變可能在男性不育的發生過程中至關重要，DAX-1或AR基因突變可能會影響兩者的相互作用，進而影響下游的靶基因，其具體分子機制有待深入研究。

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12 Muscatelli F, Strom TM, Walker AP, et al. Mutations in the DAX-1 gene give rise to both X-linked adrenal hypoplasia congenita and hypogonadotropic hypogonadism. Nature 1994; 372(6507)∶ 672-676

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（2013-12-09收稿）

Study on interaction between DAX-1 and AR protein＊

Yang Lihua, Li Yuchi, Wang Xuliang, Shi Min, Jiang Zhimao, Gui Yaoting**
Laboratory of Male Reproductive Medicine，Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, China

ObjectiveDAX-1 and AR play irreplaceable roles in male reproductive system, and show some relationship between them. This study is mainly to validate the interaction between DAX-1 and AR protein.MethodsDAX-1 eukaryotic expression vector with HA peptide tag were constructed. The recombined plasmid was sequenced and cotransfected into COS-7 cells by lipofectamineTM2000 with the eukaryotic expression vector of AR. After 48 hours, cells were collected and total protein was extracted.Co-Immunoprecipitation technique was used to detect the interaction between DAX-1 and AR protein.RessuullttssThe eukaryotic expression vector of human DAX1 was constructed successfully. The interaction between DAX-1 and AR was validated by Co-Immunoprecipitation.ConcluussiioonnDAX-1 may interact with AR protein. This study might lay the foundation for further study of DAX-1 function, mutation and the molecular mechanism of its interaction with AR.

∶ Gui Yaoting, E-mail∶ guiyaoting2007@aliyun.com; Tel∶ 0755-83923333-3320

R 697

資助∶ 深圳市科創委項目（編號：CXB201104220045A），深圳市科技計劃項目（編號：201202001，201003076）

**通訊作者, E-mail∶ guiyaoting2007@aliyun.com; Tel∶ 0755-83923333-3320

ddooii∶10.3969/j.issn.1008-0848.2014.02.002