人尿道狹窄組織的中成纖維細胞中相關因子在γ射線作用前后表達研究

屈衛星 李 晶 程永毅 徐永剛

陜西省人民醫院泌尿外科（西安 710068）

人尿道狹窄組織的中成纖維細胞中相關因子在γ射線作用前后表達研究

屈衛星 李 晶 程永毅 徐永剛

陜西省人民醫院泌尿外科（西安 710068）

目的研究人尿道狹窄組織中的成纖維細胞中iNOs、HSP47、MMP-1和MMP-2在放射線作用前后表達的變化。方法取材于人尿道狹窄段的新鮮瘢痕組織，并使用消化法與超速貼壁法分離出瘢痕成纖維細胞，在穩定傳代5～6代后，給予5Gy單次銥192γ射線照射后，使用Western-blotting半定量分析照射前后iNOs，HSP47，MMP-1和MMP-2的表達情況。結果人尿道狹窄段的瘢痕成纖維細胞在接受固定安全劑量單次照射后，在24h時，iNOs與HSP47表達降低，MMP-1和MMP-2表達升高；在48h時，iNOs表達升高，HSP47持續表達降低，MMP-1和MMP-2持續表達升高。結論 取材于人尿道狹窄瘢痕中的成纖維細胞經放射線照射后的生物學指標iNOs處于調節上游，呈時相上的雙向調節機制，處于下游的HSP47的表達受抑制，MMP-1和MMP-2表達受激活，可能在抑制成纖維細胞的增殖、減少膠原的穩定合成和促進細胞外堆積膠原的分解3個方面有效抑制瘢痕增生。

銥放射性同位素; γ射線; 尿道狹窄; 一氧化氮合酶; 基質金屬蛋白酶類; HSP47熱休克蛋白質類; 成纖維細胞

尿道狹窄術后預防復發一直以來都是令泌尿外科臨床醫生感到棘手的問題。Chiou等[1]利用超聲圖像，根據尿道狹窄的海綿體累及程度以及尿道狹窄的長度，把尿道狹窄分為5級：Ⅰ度：較短的狹窄（＜2.5cm）累及最小程度的海綿體組織。Ⅱ度：較短的狹窄伴有累及中等程度（有剩余部分海綿體組織環繞在病變尿道周圍）的海綿體組織。Ⅲ度：較短的狹窄并累及大范圍（全層）海綿體。Ⅳ度：較長（＞2.5cm）的狹窄或者合并伴有中等程度的海綿體組織累及。Ⅴ度：較長（＞2.5cm）的狹窄或者合并伴有大范圍的海綿體累及。尿道狹窄的復發與局部的瘢痕細胞的形成和增殖密切相關，在瘢痕細胞的形成和增殖過程中，促進膠原合成與分解相關的成纖維細胞中的誘導型一氧化氮合酶（inductiblenitric oxide synthase, iNOs）和基質金屬蛋白酶（matric metallo proteinases, MMPs）之間的動態平衡被打破，造成膠原過多堆積，熱休克蛋白47（ Heat Shock Proteins-47，HSP-47）也參與了瘢痕形成過程中膠原蛋白的堆積[2]。已有研究證實γ射線能有效抑制瘢痕增生，并且已經應用于臨床治療瘢痕過度增生的疾病[3]。本文擬從細胞水平解釋闡明γ射線抑制瘢痕細胞增生可能的過程及原理。

材料與方法

一、實驗材料

男性尿道狹窄瘢痕段（Ⅰ度-Ⅲ度）切除術后標本（我中心提供）；β-actin抗體、Marker（美國），HSP47鼠抗（人）單克隆抗體、MMP-1鼠抗（人）單克隆抗體、MMP-2鼠抗（人）單克隆抗體、iNOs 鼠抗（人）單克隆抗體、羊抗鼠IgG二抗（北京博奧森）。銥192γ射線源（我院放療科提供）。

二、實驗方法

（一）男性尿道狹窄段組織成纖維細胞的分離

將組織塊標本于含有抗生素的PBS液中反復沖洗數遍，去除多余的上皮組織；將組織小塊分解5mm ×5mm大小的組織小塊并適當向組織上滴加培養基使其保持濕潤。送入離心管中，加入0.25%胰酶消化液-EDTA和膠原酶-Ⅰ，在37℃恒溫水浴箱中消化4～5h，每1h振蕩1次。滴加1滴細胞混懸液在載玻片上，倒置顯微鏡下可觀察到有離散的細胞，并在紅細胞計數器下計算細胞密度。將成纖維細胞混懸液勻速滴加在燒杯上濾網進行過濾，取濾過后的成纖維細胞混懸液170.2×g，離心5min；棄去上清液，加入6mL的新鮮培養液，充分吹打細胞，細胞培養箱中（37℃，5%CO2）培養。次日絕大部分成纖維細胞己貼壁，換細胞培養基，每隔2～3d給細胞換液1次。

（二）細胞的傳代培養

觀察細胞生長情況，待細胞生長成致密單層細胞密度約為70%～80%時，可傳代培養，倒置顯微鏡下可觀察到樹突狀及梭狀成纖維細胞生長。

（三）細胞的凍存

在超凈臺中，將90%胎牛血清和10%的二甲基亞礬混合凍存液，4℃冰箱中保存。鏡下觀察細胞呈對數期生長，即鋪滿整個培養瓶底的70%，用0.25%胰酶消化液-EDTA消化，待瓶底細胞鏡下漂浮起來，棄掉消化液，用凍存液吹打均勻，細胞懸液分裝入預先消毒好的凍存管中，每管1mL；采用“慢凍速融”的原則，分別將凍存管置于4℃、-20℃、-80℃環境中各2h，然后置于液氮罐中。

（四）細胞的復蘇

取出冷凍管，迅速放入37℃水浴中，并不時搖動，在1min內使其完全融化，然后在無菌下取出細胞。在169.2×g速度下離心10min，棄去上層液，加入適量培養液后接種于培養瓶中，接種濃度0.5×109/L，置37℃溫箱靜置培養，次日更換1次培養液，繼續培養，觀察生長情況。

（五）成纖維細胞不同時間段照射后繼續觀察培養

使用銥192γ射線單次5Gy劑量照射后24h，48h后繼續觀察培養。

（六）單層貼壁成纖維細胞總蛋白的提取與Western blot檢測各組細胞中的相關因子的表達

單層貼壁成纖維細胞總蛋白的提取后SDS-PAGE電泳，終止電泳后進行轉膜。然后免疫反應（使用雜交袋進行一抗和二抗的孵育），用化學發光，顯影，定影。

結 果

使用Western blot檢測各組細胞中的相關因子的表達，與未處理的尿道瘢痕細胞相比較，在經過單次使用5Gy的劑量放射線照射24h后，iNOs與HSP47表達量降低， 而MMP-1與 MMP-2表達量升高；48h后，iNOs表達量稍升高，HSP47表達量持續降低，MMP-1與 MMP-2表達量持續升高，見圖1至圖4。

圖1 iNOs在細胞中的印跡表達

圖2 HSP47在細胞中的印跡表達

圖3 MMP-1在細胞中的印跡表達

圖4 MMP-2在細胞中的印跡表達

討 論

從本實驗結果來看，在取材于人尿道瘢痕組織中的細胞水平上，放射線照射后在細胞信號通路上的效應是可以抑制瘢痕細胞增生的。

本研究所涉及可誘發瘢痕成纖維細胞過度增殖的正向調控細胞因子iNOS和HSP-47。其中以組織中iNOS產生的NO通過調節膠原蛋白的合成作用促進瘢痕疙瘩形成[4]。且在瘢痕疙瘩成纖維細胞中給予外源性NO通過cGMP方式刺激Ⅰ型膠原的表達以及轉化生長因子β1的生成[5]，從而形成瘢痕組織。而HSP47是一種獨特的膠原特異性分子伴侶[6]。HSP47在纖維化發病機制中有明確相關性。據研究表明，在肺，腎和肝的纖維化和瘢痕疙瘩中已發現了HSP47的表達增加。這些發現表明HSP-47參與了瘢痕疙瘩形成過程中膠原蛋白的堆積。

同樣在瘢痕成纖維細胞過度增殖中扮演負向調控的相關因子是MMPs。MMP-1參與與肉芽組織和瘢痕形成密切相關的組織改建過程，MMP-1是蛋白質家族中最為特殊的一種酶，可以在單一位點分解Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型膠原的三股螺旋分子，使其解旋，之后酶被明膠酶繼續降解，從而增加了纖維源性細胞生長因子的釋放及活性作用；再者，細胞外過量沉積的膠原也可誘導MMP-1的大量表達[7,8]。MMP-2就是分解特殊的膠原蛋白-明膠。此酶可分解與膠原蛋白（明膠，膠原，層粘連蛋白）相連，C-端含有二型纖維粘連蛋白中3個重復部分，同時可分解Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型膠原分子[9,10]。從理論上講，過量表達的MMPs可促使Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型膠原降解，抑制病理性瘢痕細胞的形成。

研究表明一氧化氮信號通路對瘢痕疙瘩形成的潛在影響，從病人身體中分離出來的瘢痕疙瘩成纖維細胞被用作一個模型系統。該報告對NO/cGMP信號通路對誘導瘢痕疙瘩成纖維細胞中的纖維化因子（TGF-β，TIMP-1和HSP47）的表達效果進行了觀察，結果是正向調控，即I型膠原蛋白受到外源性一氧化氮的刺激，NO/cGMP信號通路中TGF-β的增加將激活SMAD信號級聯反應，從而增加瘢痕疙瘩成纖維細胞中金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMP-1）和HSP-47的表達增加。

在放射線照射下24h后，在通路中，iNOs的表達的顯著降低明顯抑制與瘢痕修復相關的正向調節因子TGF-β與HSP47的生成。

此外，由iNOs生成NO還可調節基質金屬蛋白酶的表達和活性[11,12]。使用大鼠腎小球系膜細胞作為研究對象的報告表明，NO在抑制膠原合成的同時，可能會增加基質金屬蛋白酶的生成和活性[13,14]。數據表明，NO將增加細胞外基質金屬蛋白酶-1的活性，分泌自AG皮膚成纖維細胞的蛋白水平與本研究結果一致。NO對膠原合成的抑制作用也可以通過其他機制進行調節。NO對兔子關節軟骨細胞中的脯氨酰羥化酶（膠原蛋白經翻譯后加工的一種重要酶）進行調節[15]。

綜上所述，NO通過以下途徑直接抑制膠原合成，這些途徑包括脯氨酸羥基化，刺激MMPs，降低轉化生長因子β（TGF-β）的生成[16,17]，啟動成纖維細胞凋亡，和（或）中和蛋白纖維化活性氧物種。在放射線照射48h后，放射線作用的生物學途徑中iNOs的表達再度上升和MMPs的持續高表達是在抑制瘢痕膠原堆積塑形中起到明顯的作用。

我們能從動物模型的組織因子研究水平上和人離體尿道瘢痕細胞因子分泌在銥192γ射線照射后的變化存在一致性[18,19]，由此認為銥192γ射線對尿道瘢痕的生長有一定抑制作用。雖然已經有應用于臨床的報道[20]，但其放射劑量的調控、效果的穩定性及遠期的副作用尚待循證醫學的進一步闡明。

1 Choiu RK, Anderson JC, Tran T,et al. Evaluation of urethral strictures and associated abnormalities using high resolution and color Doppler ultrasound.Urology1996; 47(1): 102-107

2 Bettinger DA, Yager DR, Diegelmann RF,et al. The effect of TGF on keloid fibrobast proliferation and collagen synthesis.Plast Reconstr Surg1996; 98(5): 827-833

3 王雪紅, 羅錦輝. β射線誘導成纖維細胞凋亡與防治瘢痕增生的關系. 中華整形外科雜志 2000; 20(3): 69-72

4 Hsu YC, Hsiao M, Wang LF,et al.Nitric oxide produced by iNOS is associated with collagen synthesis in keloid scar formation.Nitric Oxide2006; 14(4): 327-334

5 Hsu YC, Hsiao M, Chen YW,et al.Exogenous nitric oxide stimulated collagen type I expression and TGF-b1 production in keloid f broblasts by a cGMP-dependent manner.Nitric Oxide2007; 16(2):258-265

6 Hattori T, von der Mark K, Kawaki H,et al. Downregulation of rheumatoid arthritis- related antigen RA-A47 (HSP47/colligin-2) in chondrocytic cell lines induces apoptosis and cell-surface expression of RA-A47 in association with CD9.J Cell Physiol2005; 202(1): 191-204

7 Chegini N, Kotseos K, Zhao Y,et al. Differential expression of TGF-1 and TGF-3 in serosal tissues of human intraperitoneal organs and peritoneal adhesions.Hum Reprod2001; 16(6): 1291-1300

8 Chegini N, Kotseos K, Ma C,et al. Differential expression of integrin v and 3 in serosal tissue of human intraperitoneal organs and adhesion.Fertil Steril2001; 75(4): 791-796

9 Sheu BC, Hsu SM, Ho HN,et al. A novel role of metalloproteinase in cancer-mediated immunosuppression.Cancer Res2001; 61(1): 237-242

10 Bergers G, Brekken R, McMahon G,et al. Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis.Nat Cell Biol2000; 2(10): 737-744

11 Zaragoza C, Balbin M, Lopez-Otin C,et al.Nitric oxide regulates matrix metalloprotease-13 expression and activity in endothelium.Kidney Int2002; 61(3): 804-808 12 Trachtman H, Futterweit S, Singhal P. Nitric oxide modulates the synthesis of extracellular matrix proteins in cultured rat mesangial cells. Biochem.Biophys Res Commun1995; 207(1): 120-125

13 Dooley A, Gao B, Shi-Wen X,et al.Effect of nitric oxide and peroxynitrite on type I collagen synthesis in normal and scleroderma dermal fibroblasts.Free Radic Biol Med2007;43(2):253-264

14 Cao M, Westerhausen-Larson A, Niyibizi C,et al. Nitric oxide inhibits the synthesis of type-II collagen without altering Col2A1 mRNA abundance: prolyl hydroxylase as a possible target.Biochem J1997; 324 (Pt. 1): 305-310 15 Saura M, Zaragoza C, Herranz B,et al.Nitric oxide regulates transforming growth factor-beta signaling in endothelial cells.Circ Res2005; 97(11): 1115-1123

16 Valente EG, Vernet D, Ferrini MG,et al.L-Arginine and phosphodiesterase (PDE) inhibitors counteract f brosis in the Peyronie's fibrotic plaque and related fibroblast cultures.Nitric Oxide2003; 9(4): 229-244

17 Beltran B, Orsi A, Clementi,et al. S. Oxidative stress and Snitrosylation of proteins in cells.Br J Pharmacol2000; 129(5): 953-960

18 石磊, 孫穎浩, 許傳亮, 等. γ射線防治尿道狹窄與誘導成纖維細胞凋亡的關系. 中華實驗外科雜志 2003; 20(3): 223

19 周克斌, 趙留存, 楊勇, 等. 放療對前尿道狹窄模型兔iNOs和MMP-2的影響. 現代泌尿外科雜志 2012; 17(1): 32-35

20 屈衛星, 賀大林, 丁上書, 等. 銥192放射治療結合腔內手術治療短段前尿道狹窄的探討. 臨床泌尿外科雜志2009; 24(10): 760-762

（2014-03-15收稿）

The expression of the related factors derived from f broblasts in the human’s urethral stricture tissue expose to γ radiation

Qu Weixing, Li Jing, Cheng Yongyi, Xu Yonggang
Department of Urology, Shaanxi Provincial People's Hospital, Xi'an 710068, Shaanxi, China

ObjectiveTo detect the expressions of iNOs, HSP47, MMP-1 and MMP-2 in f broblasts of urethral stricture tissue expose toγRadiation.MethodsFresh scar tissue of urethral stricture section was collected and the f broblasts were isolated using the digestion method and speeding adherence method.The isolated cells weresubcultured 5-6 generations and exposed to the radiation with the frequency of 5Gy/1 times. The expression of iNOs, HSP47, MMP-1 and MMP-2 before and after the radiation were measured by western blot.ResultsUnder the single radiation with f xed safety dose, scar f broblasts had lower expression of iNOs and HSP47, and higherexpression of MMP-1 and MMP-2 at the time of 24h; at the time of 48h, the treated cells had higher expression of iNOs, continuously lower expression of HSP47, and continuously higher expression of MMP-1 and MMP-2.ConclusionThe expression of- iNOs in f broblasts in exposure to radioactive rays presents the time-phase and two-way regulatory mechanism, and the expression of HSP47, at the downstream, is downregulated. The expressions of MMP-1 and MMP- 2 are upregulated, which may effectively inhibit the scar proliferation by inhibiting the proliferation of f broblasts, reducing the stable synthesis of collagen, and accelerating the decomposition of extracellular accumulation collagen.

iridium radioisotopes; gamma rays; urethral stricture; nitric oxide synthase; matrix metalloproteinases; HSP47 heat-shock proteins; f broblasts

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.09.005

R 339.57; R 695.4