蜂毒肽對前列腺癌PC-3細胞凋亡誘導的影響*

呂立國白遵光**張 嫻吳巧玲陳志強王昭輝代睿欣王樹聲

1. 廣東省中醫院泌尿外科（廣州 510120）; 2. 廣東省中醫院中心實驗室; 3. 廣東省中醫院腫瘤科

蜂毒肽對前列腺癌PC-3細胞凋亡誘導的影響*

呂立國1白遵光1**張 嫻2吳巧玲3陳志強1王昭輝1代睿欣1王樹聲1

1. 廣東省中醫院泌尿外科（廣州 510120）; 2. 廣東省中醫院中心實驗室; 3. 廣東省中醫院腫瘤科

目的研究蜂毒肽（Melittin）對人前列腺癌PC-3細胞凋亡的影響及可能機制。方法實驗設立空白對照組和蜂毒肽不同濃度組，用MTT方法檢測細胞增殖，Hoechst 33258染色檢測細胞凋亡，RT-PCR檢測p27、p53 mRNA表達，Western blot檢測蛋白表達。結果與對照組比較，蜂毒肽作用24、48、72 h后，4、8、16、32μg/mL組MTT檢測OD值明顯降低，細胞凋亡率明顯增高（P＜0.05），作用48h后，p27、p53 mRNA表達明顯升高（P＜0.05），p53和 Caspase3蛋白含量增高。結論 蜂毒肽對PC-3細胞有凋亡誘導作用，其作用機制可能與增高p27、p53、Caspase3表達相關。

蜂毒肽; 前列腺腫瘤; 細胞系, 腫瘤; 細胞凋亡

目前在世界范圍內前列腺癌發病率正居男性惡性腫瘤的第二位[1]，在美國，發病率占男性惡性腫瘤的第一位。確診時多為晚期。內分泌治療是晚期前列腺癌的主要治療方法，但經過中位時間14～30個月后，幾乎都會發展為去勢抵抗性前列腺癌（CRPC），中位生存期短。如何延緩晚期前列腺癌進展為CRPC、如何延長CRPC生存期，是世界范圍內的治療難點。中醫藥治療CRPC逐漸成為研究的熱點。本研究擬結合現代醫學研究成果，探討蜂毒肽對PC-3細胞凋亡的影響及其作用機制，為進一步的臨床應用提供理論依據，為CRPC的治療提供思路。

材料和方法

一、試驗藥物

蜂毒肽,購于美國Sigma公司, 純度91.8%，批號：060M4079V。用培養基稀釋至終濃度為：1、2、4、8、16、32μg/mL。

二、細胞

前列腺癌PC-3細胞，購于中山大學實驗動物中心細胞實驗室。

三、試劑

四氮甲基唑藍（MTT），美國Sigma公司；DMEM培養基、胎牛血清、0.25%胰酶消化液，美國Hyclone公司；Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒,RNA提取試劑Trizol，美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒，Takara公司。 所用化學試劑均為分析純，購于廣州化學試劑廠。

四、儀器

酶標儀(美國Perkin Elmer公司），流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司，FC500），7500實時熒光定量基因擴增系統（美國ABI公司），凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）。

五、方法

前列腺癌PC-3細胞用含5%FBS的DMEM，37℃，5% CO2，飽和濕度恒溫培養箱培養，0.25%胰酶消化傳代。實驗設蜂毒肽1、2、4、8、16、32μg/ mL組和空白對照組，作用時間為24，48，72h。各實驗均重復3次。

（一）MTT實驗

細胞消化后計數，接種至96孔培養板，每孔100μL，設5個復孔，細胞貼壁后加入作用藥物，培養24，48，72h后加入5%MTT溶液20μL，繼續培養4h，后吸去上清，每孔加入100μL DMSO溶液，室溫振蕩溶解10min后，酶標儀檢測570nm波長的OD值。細胞增殖抑制率=（對照組OD值-藥物組OD值）/對照組OD值×100%。

（二）Hoechst 33258染色檢測細胞凋亡

細胞接種于6孔板中，按上述各組處理進行培養。作用完成后，加入Hoechst 33258染液按照說明進行細胞染色，用倒置熒光顯微鏡檢測細胞凋亡率。

（三）RT-qPCR檢測mRNA表達

細胞分組處理后，收集細胞用Trizol提取總RNA，測定濃度后逆轉錄合成cDNA，用SYBR Green染料法熒光定量PCR（Real Time PCR）檢測，并用內參基因GAPDH進行校正分析p53 mRNA表達含量。引物序列如下：p53基因前向引物： 5’-ATGT GCTGTGACTGCTTGTAGATG-3’，逆向引物：5’-TCAACAAGATGTTTTGCCAACT-3’；GAPDH前向引物：5’-TCTTTTGCGTCGCCAGCC GA-3’，逆向引物：5’-AGTTAAAAGCAGCCCTGGTG ACCA-3’； p27kip前向引物：5’- AGTGTCTAAC GGGAGCCCTA -3’，逆向引物：5’- CCGGGTT AACTCTTCGTGGT-3。

六、統計分析方法

結 果

一、MTT檢測結果

與對照組比較，蜂毒肽在4、8、16、32μg/mL濃度作用后，OD570nm明顯降低，提示蜂毒肽能抑制PC-3細胞增殖或能促進細胞凋亡，其中濃度8、16、32μg/mL組之間作用效果無明顯差異，故后續選用1、4、8μg/mL作為實驗濃度（見圖1）。

圖1 蜂毒肽對PC-3細胞增殖影響

二、Hoechst染色結果

蜂毒肽能誘導細胞凋亡，在作用48h后，與對照組比較，1μg/mL組無明顯凋亡，4μg/mL組細胞凋亡率明顯升高，濃度8μg/mL時，細胞凋亡率＞70%，（見圖2）。

三、RT-PCR實驗結果

發現蜂毒肽作用后，PC-3細胞p53和p27蛋白的相對表達量明顯增加（見圖3）。

四、 Western blot 實驗

在蜂毒肽作48h后， 1μg/mL、4μg/mL、8μg/ mL組細胞p53表達均增高， 4μg/mL、8μg/mL 組Procaspase3活化剪切增多，Caspase3含量增高，凋亡增加（見圖4）。

圖2 蜂毒肽對PC-3細胞凋亡的影響

圖3 Mel誘導PC-3細胞p27、p53 mRNA表達

圖4 蜂毒肽對PC-3細胞p53、Caspase蛋白表達的影響

討 論

蜂針療法是中醫傳統療法，具有抗腫瘤的作用，初步臨床研究顯示，蜂針療法在控制前列腺癌進展方面有潛在的作用。蜂毒肽是蜂毒的主要成分，具有多種抗腫瘤作用[2]，實驗研究證實，蜂毒肽對前列腺癌細胞具有增殖抑制和凋亡誘導作用，并揭示了部分可能的作用機制[3,4]。目前研究已經明確的前列腺癌細胞增殖與凋亡的調控機制很多，包括Bcl-2/bax失衡[5]、P53蛋白過表達[6]、凋亡抑制基因Survivin過表達[7,8]、Caspase通路[9,10]等。為進一步明確蜂毒肽對前列腺癌細胞的作用及機制，我們進行了上述實驗。

實驗結果證實，與對照組比較，作用24、48、72 h后，蜂毒肽對PC-3細胞有明顯的抑制增殖作用，在濃度4、8、16、32μg/mL作用48 h后，PC-3細胞凋亡和死亡細胞數量均明顯增多，表明蜂毒肽對前列腺癌PC-3細胞具有凋亡誘導作用。進一步研究發現，蜂毒肽處理后的PC-3細胞p27、p53 mRNA的表達量明顯升高，推測p27、p53調控是其凋亡誘導作用途徑之一。

p27是細胞周期的負性調控因子，被認為是抑癌基因。在正常細胞和腫瘤細胞中，p27通過抑制細胞周期依賴性蛋白激酶的活性負性調節細胞周期的進程，抑制細胞增殖。也有研究發現p27參與細胞分化調控，誘導細胞凋亡[11]。由此推測，蜂毒肽可以通過調控p27表達誘導PC-3細胞凋亡。

p53是一種抑癌基因，能夠通過多種機制阻止腫瘤發展它也是一種轉錄因子，一種生長抑制性蛋白，在前列腺癌發生發展中起重要作用。研究[12]證實，p53蛋白可誘導PC-3細胞凋亡，PC-3細胞存在依賴p53的凋亡途徑。本實驗發現，蜂毒肽處理后p53表達明顯升高，由此推測，通過調控p53表達誘導PC-3細胞凋亡，是蜂毒肽誘導PC-3細胞凋亡的作用途徑之一。p53可以激活導致Procaspase3 的剪切生成有活性的Caspase3。

Caspases是在細胞凋亡中起重要作用的同源蛋白，是細胞凋亡的中心環節，對細胞凋亡起著重要作用。其中Caspase-3是細胞凋亡過程中激活的關鍵激酶，也是細胞凋亡的主要效應因子，是細胞凋亡的執行者，是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，也是CTL細胞殺傷機制的重要組成部分。Caspase-3蛋白與進展性前列腺癌細胞的耐凋亡特征、惡性程度和復發性有關。Caspase-3的低陽性率與進展性前列腺癌的發生、發展和預后有密切聯系[13]。 Caspase-3活性下降，與激素非依賴性前列腺癌發生和進展過程相關[14]。研究顯示，某些中藥提取物[15,16]可以通過上調Caspase-3表達，抑制PC-3細胞的增殖。本實驗顯示，蜂毒肽作用后Caspase-3含量增高，由此推測，Caspase-3通道也是蜂毒肽對PC-3細胞發揮凋亡誘導作用的途徑之一。

總之本實驗揭示了蜂毒肽對PC-3細胞的凋亡誘導作用及可能的機制，為蜂針療法進一步的臨床應用提供了理論依據，蜂毒肽對PC-3細胞凋亡誘導作用是否存在其他途徑，如何在此基礎上開展結合蜂毒肽的前列腺癌生物治療，有待進一步的深入研究。

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（2014-07-23收稿）

Effects of Melittin on apoptosis of prostate cancer cell PC-3*

Lv Liguo1, Bai Zunguang1**, Zhang Xian2, Wu Qiaoling3, Chen Zhiqiang1, Wang Zhaohui1, Dai Ruixin1, Wang Shushing11. Department of Urology, Guangdong Province Hospital of Tranditional Chinese Medicine, Guangzhou 510120,
Guangdong, China; 2.Central Laboratory, Guangdong Province Hospital of Tranditional Chinese Medicine;
3. Department of Oncology, Guangdong Province Hospital of Tranditional Chinese Medicine

Bai Zunguang, E-mail: zunguangbai@163.com

ObjectiveTo study the effects of Melittin (Mel) on apoptosis of prostate cancer cell PC-3 and explore its potential mechanism.MethodsBlank control Group and Mel groups of different concentrations were set up in this study. Cell proliferation was analyzed by MTT assay. Cell apoptosis was measured by Hoechst 33258 dying method. The expressions of p27and p53were detected by RT-qPCR, and their protein expressions were detected by Western blot.ResultsCompared with those of the controls, cell proliferation (OD value) decreased and apoptosis increased signif cantly in Mel groups of 4, 8, 16, 32μg/mL after 24, 48 and 72 h treatment. After 48h treatment, the expressions of p27 andp53 mRNA were increased signif cantly, and protein expression of p53 and caspase3 were also increased.ConclusionMel may induce PC-3 cell apoptosisby upregulation of p27, p53 and caspase3 expression.

melitten; prostatic neoplasms; cell line, tumor; apoptosis

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.09.003

R 737.25

資助: 廣東省科技計劃項目（2012B061700035）
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, E-mail: zunguangbai@163.com