轉染Cox7a2重組質粒對大鼠支持細胞分泌功能和ERK磷酸化水平的影響*

張 鐵劉保興張秀平徐亞平

1．中日友好醫院檢驗科（北京 100029）；2. 中日友好醫院男科；3. 中日友好醫院臨床醫學研究所

·論 著·

轉染Cox7a2重組質粒對大鼠支持細胞分泌功能和ERK磷酸化水平的影響*

張 鐵1劉保興2**張秀平2徐亞平3

1．中日友好醫院檢驗科（北京 100029）；2. 中日友好醫院男科；3. 中日友好醫院臨床醫學研究所

目的觀察大鼠睪丸支持細胞轉染細胞色素C氧化酶7a2（Cox7a2）重組質粒后對支持細胞分泌功能及細胞外信號調節激酶（ERK）磷酸化水平的影響。方法培養原代大鼠睪丸支持細胞，將細胞分為空白對照組、空載體組、重組質粒組。將pEGFP-C1-Cox7a2重組質粒轉染支持細胞24h后，收集細胞上清液，采用酶聯免疫法，測定轉鐵蛋白（TF）、白細胞介素-1（interleukin-1, IL-1）β、白細胞介素-6（IL-6）含量。Western blot檢測ERK的磷酸化水平。結果重組質粒組TF為（14.11±0.45）pmol/mL，顯著低于空白對照組（24.3±0.64）pmol/mL和空載體組（25.16± 0.42）pmol/mL（P＜0.01）。重組質粒組IL-1β、IL-6水平分別為（157.14±12.69）pg/mL、（0.79±0.04）pg/mL，顯著高于空白對照組（33.05±1.92）pg/mL、（0.25±0.01）pg/mL和空載體組（40.46±6.69）pg/mL、（0.37±0.03）pg/mL，差異均具統計學意義（P＜0.01）。與空白對照組和空載體組相比，重組質粒組ERK1/2磷酸化水平明顯增高（P＜0.01）。結論 轉染Cox7a2重組質粒后損害了大鼠睪丸支持細胞的分泌功能，提高ERK1/2磷酸化水平。

細胞色素C氧化酶7a2（Cox7a2）; 支持細胞; 細胞外信號調節激酶

睪丸支持細胞在生精過程中起著非常重要的作用, 被稱為生精細胞的“保姆細胞”[1-3]。支持細胞為生精細胞提供支架、參與血睪屏障，供給生精過程所需的能量及營養物質，同時能分泌數十種活性物質，其中轉鐵蛋白（transferrin，TF）是其功能性標志產物，可直接反映支持細胞的功能狀態[4,5]。有研究證實：白細胞介素-1（interleukin-1,IL-1）β、白細胞介素-6（IL-6）不僅是促炎性細胞因子而且能調節生精內環境[6,7]。細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）是促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）家族的一員，它的信號傳遞途徑是涉及調節細胞生長、發育及分裂的信號網絡的核心。細胞色素C氧化酶7a2（Cox7a2）是線粒體細胞色素C氧化酶（Cytochrome c oxidase，COX）亞基，與相應細胞分泌功能密切相關。既往我們已經構建了pEGFP-C1-Cox7a2表達載體[8]，本研究觀察重組質粒轉染大鼠睪丸支持細胞后對支持細胞分泌產物TF、IL-1β、IL-6表達的影響及對ERK磷酸化水平的影響。

材料與方法

一、主要材料和儀器

PCR儀（中國杭州博日科技公司產品），離心機（美國Thermo產品），電泳儀（北京六一儀器廠產品）,酶標儀（美國Thermo產品）。DMEM/F12培養基（美國Sigma公司），Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶（美國Sigma公司），胎牛血清（德國Biochrom公司），TF、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）。兔抗人ERK多克隆抗體及抗p-ERK（Thr202/Tyr204）多克隆抗體（美國Cell Signaling公司），HRP-標記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

二、大鼠睪丸支持細胞的分離培養與鑒定

18～21d齡雄性SD大鼠頸椎脫臼法處死，無菌取出睪丸，Hank's清洗后，剝離出睪丸組織，剪碎，加入0.25%胰酶于37℃5%CO2培養箱中消化45mim。加入胎牛血清終止消化，離心（900×g, 3min）×2，去除胰酶；加入0.1%Ⅰ型膠原酶于37℃，5%CO2培養箱中消化20min，加入胎牛血清終止消化，100目細胞篩過濾，加入Hank's液混勻，離心900×g，3min×2，去除膠原酶；加入培養液（DMEM/F12，20%胎牛血清，青霉素100U/mL, 鏈霉素100U/mL）制成單細胞懸液，48h后，加入20mmol/L Tris-HCL（pH值7.4），繼續培養。采用HE染色和Fas-L免疫組織化學鑒定。

三、質粒轉染及支持細胞分泌產物（TF、IL-1β、IL-6）測定

將生長狀態較好的大鼠支持細胞，分別接種于6孔板中，密度為：5×105左右。培養18h后，將空載體或重組質粒轉染原代支持細胞。轉染前每個孔加入：500μL無雙抗的培養基，每孔加入2μL lipo2000，室溫放置5min。分裝，50μL/孔。取質粒4μL，用50μLOPti-MEM進行稀釋，混合后，室溫放置20min。分別對應將脂質體和質粒進行混勻。滴加到細胞培養基中，混勻。37℃CO2培養6h后，將培養基換成含有雙抗的600μL培養基。轉染24h后，收集細胞上清液，-80℃保存。采用酶聯免疫法，波長450nm，測定TF、IL-1β、IL-6含量。

四、ERK磷酸化水平的測定

收集各組細胞，加入RIPA裂解液冰上裂解20 min，4℃ 10 008×g，離心20 min，取上清，BCA法（Pierce公司）蛋白定量。加入SDS上樣緩沖液，95℃ 5min，行SDS-PAGE 電泳，上樣量為20μg總蛋白。濕轉法恒壓100v，轉膜1 h，室溫封閉1 h， 抗p-ERK一抗4 ℃搖床上孵育過夜，二抗（HRP-羊抗兔IgG）室溫封閉1 h，ECL顯影。顯影后PVDF膜經洗脫后二次雜交，此時一抗為抗ERK抗體。膠片經凝膠成像分析系統掃描、成像，（p-ERK/ERK）×100%表示ERK活化水平。

五、統計方法

結 果

一、大鼠睪丸支持細胞鑒定

大鼠睪丸支持細胞形態均一，呈梭形，純度80%，胞體呈長柱狀或不規則狀，有多個突起，細胞核為卵圓形或不規則形，位于胞體中央（圖1A）。支持細胞HE染色后見：胞體為寬大的柱狀或不規則狀，有多個粗大的突起，細胞核呈卵圓或不規則形（圖1B）。支持細胞經 Fas-L 免疫組化染色見：胞漿及胞膜呈棕黃色著色，為 Fas-L 陽性表達（圖1C）。

圖1 支持細胞鑒定

二、Cox7a2轉染重組質粒對支持細胞分泌產物的影響

與空白對照組和空載體組相比，重組質粒組IL-1β、IL-6水平顯著增高，TF水平顯著下降 ，差異均具統計學意義（P＜0.01）（表1）。

三、Cox7a2轉染重組質粒對ERK磷酸化水平的影響

與空白對照組和空載體組相比，重組質粒組ERK1/2磷酸化水平明顯增高（P均＜0.01）（圖2）。

表1 各組大鼠支持細胞分泌產物檢測結果的比較（）

表1 各組大鼠支持細胞分泌產物檢測結果的比較（）

注:*與空白對照組比較P＜0.01;#與空載體組比較P＜0.01

組別 TF IL-1β IL-6 (pmol/mL) (pg/mL) (pg/mL)空白對照組 24.30±0.64 33.05±1.92 0.25±0.01空載體組 25.16±0.42 40.46±6.69 0.37±0.03*重組質粒組 14.11±0.45*#157.14±12.69*#0.79±0.04*#

圖2 Cox7a2重組質粒對ERK磷酸化水平的影響

討 論

Cox7a2是COX的亞基，由細胞核編碼，與活性氧的產生和ATP的合成密切相關，為COX維持正常功能所必需[9-11]，轉染Cox7a2重組質粒24h后可降低小鼠支持細胞COX活性[12]。Cox7a2轉染TM3小鼠間質細胞后，可抑制LH誘導的睪酮分泌，并抑制睪酮合成限速酶-類固醇合成快速調節蛋白StAR的表達[13]。

支持細胞可分泌多種物質，其中分泌的蛋白類主要有轉運蛋白和調節蛋白[14]。轉運蛋白TF被認為是支持細胞分泌功能的生物學標志。TF是一種能結合鐵的蛋白質，能把鐵離子從吸收和儲存的地方運輸到小鼠支持細胞[15]。支持細胞還可以分泌免疫調節因子，如IL-1，其中IL-1β主要通過自分泌或旁分泌來刺激其他的細胞因子和炎癥介質產生IL-6等物質[14]。支持細胞是某些影響睪丸生精功能化學毒物的靶細胞，化學毒物對支持細胞分泌功能的損傷表現為TF濃度降低，IL-1β和IL-6濃度升高[16,17]。我們的研究顯示：與空白對照組和空載體組相比，轉染Cox7a2重組質粒后，支持細胞分泌產物IL-1β、IL-6水平顯著增高，TF水平顯著下降，表明Cox7a2過表達可損傷支持細胞分泌功能。

ERK是MAPK家族的一員，它的信號傳遞途徑是涉及調節細胞生長、發育及分裂的信號網絡核心，活化的ERK可磷酸化核內多種蛋白質，從而影響細胞增殖、發育、分化、存活[18]。研究顯示，MAPK家族在氧化劑誘導的信號通路中發揮著重要作用[19,20]，活性氧可激活ERK1/2通路[21]。化學毒物雙酚A可降低TF濃度，此過程呈ERK途徑依賴性。同時可升高IL-1β和IL-6濃度，此過程呈部分ERK途徑依賴性[16]。順鉑也可通過提高磷酸化ERK水平進而降低TF濃度[17]，而壬基苯酚可通過產生活性氧和活化ERK通路使小鼠TM4支持細胞凋亡增加[22]。我們的研究顯示：轉染Cox7a2重組質粒后，在支持細胞分泌功能損傷的同時ERK磷酸化水平顯著升高，但其具體機制尚有待進一步研究。

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（2014-01-10收稿）

Analysis of cell secretion function and the phosphorylation level of extracellular signal-regulated kinase in rat sertoli cell transfected with Cox7a2 recombinant plasmid*

Zhang Tie1, Liu Baoxing2**, Zhang Xiuping2, Xu Yaping3
1. Department of Clinical Laboratory Medicine, China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029, China;
2. Department of Andrology, China-Japan Friendship Hospital; 3.Institute of Clinical Medical Sciences, China-Japan Friendship Hospital

Liu Baoxing, Email: liubx66@163.com

ObjectiveTo investigate cell secretion function and the phosphorylation level of extracellular signalregulated kinase in rat sertoli cell transfected with Cox7a2 recombinant plasmid.MethodsRat SCs were cultured and divided into three groups such as the control group, the mock group and the recombinant plasmid group. After 24h culture, the culture supernatants of the transfected cells were collected and the levels of transferrin (TF) , interleukin(IL)-1β and IL-6 in culture medium were measured by ELISA. The level of ERK phosphorylation in the transfected cells was detected by Western Blot.ResultsThe level of TF was signif cantly decreased in the recombinant plasmid group as compared with that of the control group and the mock group (P<0.05) .The levels of IL-1β and IL-6 (157.14±12.69 pg/mL and 0.79±0.04 pg/mL) in the recombinant plasmid group were signif cantly higher than those of the control group and the mock group(33.05±1.92 pg/mL, 0.25±0.01pg/mL; 40.46±6.69pg/mL, 0.37±0.03pg/mL,P<0.01), and the level ofERK phosphorylation was also increased signif cantly(P<0.01).ConclusionThe cell secretion function was impaired in rat SCs transfected with Cox7a2 recombinant plasmid but the phosphorylation level of ERK was increased.

Cox7a2; sertoli cells; extracellular signal-regulated kinases(ERK)

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.04.001

R 321.1

資助: 國家自然科學基金（81072809）北京市自然科學基金（7102140）資助項目
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, Email: liubx66@163.com