甲基硒酸對前列腺癌Lncap細胞的促凋亡作用*

劉艷波孫媛媛徐 杰焦 橋費聰聰趙曉暉蘆麗莉**董 妍趙雪儉

1. 北華大學基礎醫學院（吉林 132013）; 2. 吉林大學前列腺疾病防治研究中心; 3. 美國杜蘭大學生命科學研究中心

甲基硒酸對前列腺癌Lncap細胞的促凋亡作用*

劉艷波1,2孫媛媛1徐 杰1焦 橋1費聰聰1趙曉暉1蘆麗莉1**董 妍2,3**趙雪儉2

1. 北華大學基礎醫學院（吉林 132013）; 2. 吉林大學前列腺疾病防治研究中心; 3. 美國杜蘭大學生命科學研究中心

目的探討甲基硒酸（methylseleninic acid，MSA）對前列腺癌Lncap細胞促凋亡效應，并初步探討發生機制。方法 將體外培養的Lncap細胞分為4組，即空白對照組（mock），MSA低劑量組（1.25μM）、中劑量組（2.50μM）和高劑量組（5.00μM），MSA分別作用24h、48h和72h，倒置顯微鏡下觀察細胞形態，SRB法檢測細胞增殖情況；流式細胞術檢測細胞周期及凋亡；免疫熒光及免疫細胞化學法檢測細胞內stat3的表達。結果光鏡及SRB實驗結果顯示：隨MSA劑量增加及作用時間延長，Lncap細胞生長受到明顯抑制；流式細胞術結果表明：MSA呈劑量及時間依賴關系促進細胞凋亡，并使細胞周期分布發生改變，多數細胞被阻滯于G0～G1期；免疫熒光及免疫組織化學結果發現：與對照組相比，MSA可明顯抑制細胞內stat3表達。結論MSA抑制細胞增殖并促進細胞凋亡，其發生機制可能與降低stat3表達，進而抑制下游增殖基因表達有關。

前列腺癌; 甲基硒酸; 細胞凋亡; stat3轉錄因子

硒是人體必需的微量元素，具有廣泛的生物學功能，如含硒蛋白質谷胱甘肽過氧化物酶和硫氧蛋白還原酶，是細胞內氧化還原平衡的重要調節劑，對維持細胞功能意義重大[1]。此外，硒具有降低前列腺癌發病的作用，如成年男性每天補充200μg的硒可使前列腺癌的發病危險性降低50%[2]。但硒抗癌活性取決于化學構成，一般來講，無機硒化合物如硒酸鹽或亞硒酸鹽可損害DNA，造成遺傳毒性，臨床應用受到較大限制；有機硒化合物根據藥代動力學不同其抗癌活性也差異較大[3,4]；較穩定的硒前體化合物如甲基硒酸（methylselenic acid，MSA）在體內可迅速被代謝成具有抗癌活性的甲基硒（methylselenol），能抑制激素非依賴性前列腺癌PC-3細胞的生長。本研究在此基礎上探討MSA對激素依賴性前列腺癌細胞Lncap的作用及相關機制，為體內實驗奠定基礎。

材料與方法

一、實驗材料

（一）實驗試劑

Lncap細胞株由吉林大學前列腺疾病防治研究中心饋贈，MSA為美國Sigma公司產品，由美國杜蘭大學張海濤博士惠贈；胰酶、RPMI-1640培養基、胎牛血清為美國Hyclone公司產品；小鼠抗人stat3抗體購自Santa Cruz公司，山羊抗小鼠IgG二抗（紅熒光CY3標記）購自sigma公司，HRP標記的山羊抗小鼠二抗購自上海北諾生物科技有限公司，DAB購自北京中杉試劑公司、其它常規化學試劑均為進口或國產分析純產品。

（二）實驗儀器

倒置相差顯微鏡（Olympus，日本）；熒光顯微鏡（Olympus，日本）；超凈工作臺（YZ-875蘇州凈化設備廠）；自動CO2恒溫培養箱（SANYO，日本）；自動高壓蒸氣消毒器（SONY，日本）；低溫冰箱（-80℃ SANYO，日本）； 恒溫水浴箱（江蘇常州國華儀器廠）；紫外分光光度計及分析工作站（島津Shimadazi，日本）；加樣器（JECONS，芬蘭）等。

二、實驗方法

（一）細胞培養

前列腺癌細胞株Lncap 1×106分別接種在100ml培養瓶中，用RPMI-1640培養基（含10%胎牛血清），37℃，5% CO2培養。當貼壁細胞達到70%～80%融合，分組給藥。

（二）細胞生長抑制實驗-SRB（sulforhodamine B，SRB）法

將細胞濃度調整為2×105/ml后接種于96孔平底培養板，每孔100μl（2×104/孔）。分為mock組，MSA給藥組（MSA1.25、2.50和5.00μM），每組設4復孔，待細胞達到70%左右融合時，分組給藥，并設24h，48h，72h三個時間點。培養至48h時在相差顯微鏡下觀察拍照后；每孔輕柔加入50μl經4℃預冷的500ml/L三氯醋酸，置4℃1 h，自來水洗5次，空氣干燥后，加4 g/L SRB染色15～30 min，用醋酸洗滌5遍，干燥后，加入10mmol/L Tris液100μl溶解，微振器上振蕩10min，在酶聯檢測儀上測波長570nm光的吸光度(A)值。按公式抑制率%=（對照組A均值-實驗組A均值）/對照組A均值×100%計算各組抑制率，抑制率＞30%即對該藥敏感性高。實驗重復3次。

（三）流式細胞術檢測凋亡

將生長狀態良好的Lncap細胞分為4組，加藥48h后，收集細胞后離心， 70% 冷乙醇中4℃固定12h。PBS洗2次，調整細胞濃度為1×106/ml，用RNase消化后，加入1.5ml PI（5mg/100ml）對DNA進行染色，混勻后在流式細胞儀上進行單參數分析。

（四）免疫熒光染色

將大小合適的蓋玻片置于12孔板內，各組細胞于加藥48h后PBS洗一次；用新鮮配制的4%多聚甲醛固定細胞20min，PBS洗5次，0.2% TritonX-100打孔，1%BSA室溫封閉10min；滴加磷酸化Stat3多克隆抗體（1:300，由1%PBS BSA配制）室溫孵育2h；2.7%NaCl洗2×5min； PBS清洗2×5min；滴加CY3標記的熒光二抗（1:20由1%PBS BSA配制）避光室溫孵育細胞1h，熒光顯微鏡下觀察stat3在各組細胞中的分布，拍照。

（五）免疫細胞化學染色

將大小適合的蓋玻片放入6孔培養板中，接種細胞為5×105/孔，37℃，5%CO2中培養，次日加藥，繼續培養48h，PBS清洗，4%多聚甲醛固定，0.2% TritonX-100打孔，免疫細胞化學染色觀察細胞內stat3表達情況。

結 果

一、相差顯微鏡下觀察細胞形態

對照組細胞貼壁生長，狀況良好，多為長梭形，可見聚集現象，核仁清晰，可見核分裂相，細胞折光性好，增殖旺盛，漂浮細胞少見；MSA組隨劑量增加及給藥時間的延長細胞生長緩慢，形態不規則，細胞皺縮，顆粒增多，可見細胞碎片和漂浮細胞；部分細胞失去原有形態，細胞核固縮，細胞數目明顯減少，見圖1

圖1 MSA作用于Lncap細胞48h后細胞形態（×200）A: mock B :1.25μM MSA C: 2.50 μM MSA D: 5.00μM MSA

二、MSA對Lncap細胞增殖抑制作用（SRB法）

利用SRB法檢測不同濃度的MSA對Lncap細胞增殖抑制作用。分別于給藥后24h、48h及72h后進行檢測，以mock組增殖抑制率為0%，則1.25μM MSA組細胞增殖抑制率分別為1.24%，5.36%和9.21%；2.50μM MSA組細胞增殖抑制率分別為9.23%，21.62%和39.42%；5.00μM MSA組細胞增殖率分別為18.36%，30.67%和65.32%。抑制率表現明顯的時間和劑量依賴關系（表1

表1 MSA對前列腺癌Lncap細胞增殖的影響（±s，n=4）

表1 MSA對前列腺癌Lncap細胞增殖的影響（±s，n=4）

*: 與對應的mock組比較，P＜0.05;#: 與對應的1.25μM MSA值比較，P＜0.05

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三、MSA對Lncap細胞凋亡的影響

收集MSA作用后48h的細胞進行細胞周期及凋亡檢測。結果表明：與mock組相比，Lncap細胞經1.25μM、2.50μM、5.00μM MSA處理后，均出現了明顯的細胞凋亡現象，其凋亡率分別為14.7%， 33.1%，52.8%，表現為劑量依賴關系，其凋亡率和細胞周期分析見表2

表2 MSA對前列腺癌Lncap細胞細胞周期及凋亡的影響

四、MSA對stat3表達的影響

實驗結果表明：mock組細胞stat3主要表達在胞漿，細胞核內也可見紅色熒光；MSA給藥組Lnca細胞胞漿中紅色熒光表達明顯減少，即5.00μM MSA可降低stat3表達（圖2）。為了進一步證實MSA降低細胞內stat3的表達，又通過細胞免疫化學染色法進行檢測，DAB染色發現：mock組stat3蛋白表達明顯高于5.00μM MSA組；stat3蛋白表達的陽性顆粒主要位于Lncap細胞胞漿，也有少部分位于胞核內（圖3）。stat3免疫熒光檢測結果與免疫細胞化學染色結果相吻合。

圖2 MSA對前列腺癌細胞內stat3表達的影響（×200）

圖3 免疫細胞化學法檢測MSA對細胞內stat3表達的影響（×200）

討 論

前列腺癌發病率在美國中老年男性惡性腫瘤中居首位，死亡率位于第二位。因此前列腺癌的防治一直是泌尿生殖系統熱點問題。有大量的研究表明，含硒化合物具有預防及治療前列腺癌作用，但治療效果取決于硒的化學組成。MSA作為有機硒的前體，可代謝為低毒甚至無毒的含硒物質，可干擾雄激素受體（androgen receptor，AR）啟動子的活性，并呈現出時間及劑量關系[5-7]。本實驗結果表明：MSA低、中、高劑量組均可抑制細胞增殖，隨時間延長及劑量增加對細胞增殖抑制作用增強。Dong等[6]研究發現， MSA能以劑量及時間依賴性的方式抑制PC-3細胞的生長并介導細胞的凋亡，利用基因芯片鑒定出了MSA作用后變化較為明顯的14個基因，發現MSA介導的細胞周期阻滯可能是通過上調p19INK4d和p2lwAF1基因，以及下調CDK1，CDK2和cyclinA來實現的。Zhao等[8]將MSA加入Lncap細胞培養液中，利用基因芯片發現MSA作用于細胞后，多種細胞周期調控基因的mRNA表達水平發生了劇烈變化，同時細胞增殖受抑，細胞大量積聚在G0/G1期，并且發現MSA還可以調節雄激素調控基因的表達，抑制雄激素受體的表達并降低PSA的分泌量。

為了證實MSA促進細胞凋亡及抑制細胞增殖效應是否與stat3的表達改變有關，本研究通過熒光免疫及細胞免疫染色法觀察了細胞內stat3的表達情況。stat3是stat家族重要的信號蛋白之一，在相應配體刺激下，stat3第Y705位酪氨酸殘基發生磷酸化，以二聚體形式轉位進入細胞核，并與相應DNA反應元件結合，刺激下游相關基因的轉錄，進而促進細胞增殖及新生血管生成等。在許多腫瘤（包括前列腺癌）發生發展過程中，stat3持續激活，表現為細胞凋亡減少、增殖迅速、腫瘤內血管密度增加、產生耐藥效應，腫瘤存活時間延長[9-11]。有研究證實：硒化合物可抑制腫瘤細胞stat3的轉錄，進而抑制下游基因VEGF表達，表現出促凋亡及抗增殖活性[12]。本研究利用免疫熒光染色及免疫細胞化學染色檢測了stat3在Lncap細胞的表達情況，結果表明：mock組stat3表達明顯增加，stat3主要位于細胞漿，少量位于細胞核，5.00μM MSA作用細胞48h后，熒光及組化染色較對照組比較明顯降低，說明MSA可降低前列腺癌細胞內stat3的表達，進而抑制細胞的增殖并促進細胞凋亡，其信號轉導的具體通路還有待于進一步探討。

由此可見，MSA體外對激素依賴性前列腺癌細胞生長具有明顯抑制效應，與抑制stat3的表達關系密切，為體內研究奠定了堅實的基礎。

1 Arner ES, Holmgren A. The thioredoxin system in cancer. Semin. Cancer Biol 2006; 16(6): 420-426

2 Ashughyan VR, Marihart S, Djavan B. Chemopreventive Trials in Urologic Cancer. Rev Urol 2006; 8(1): 8-13

3 Christensen MJ, Quiner TE, Nakken HL, et al. Combination effects of dietary soy and methylselenocysteine in a mouse model of prostate cancer. Prostate 2013; 73(9): 986-995

4 Zhang J, Wang L, Li G, et al. Mouse prostate proteomes are differentially altered by supranutritional intake of four selenium compounds. Nutr Cancer 2011; 63(5): 778-789

5 Dong Y, Zhang H, Hawthorn L, et al. Delineation of the molecular basis for selenium-induced growth arrestin human prostate cancer cells by oligonucleotide array. Cancer Res 2003; 63(1): 52-59

6 Dong Y, Lee SO, Zhang H, et al. Prostate specifi c antigen expression is down-regulated by selenium through disruption of androgen receptor signaling. Cancer Res 2004; 64(1): 19-22

7 Cho SD, Jiang C, Malewicz B, et al. Methyl selenium metabolites decrease prostate specific expression by inducing protein degradation and suppressing androgen-stimulated transcription. Mol Cancer Ther 2004; 3(5): 605-611

8 Zhao H , Whitfield ML, Xu T, et al. Diverse effects of methylseleninic acid on the transcriptional program of human prostate cancer cells. Mol Biol Cell 2004; 15(2): 506- 519

9 Bromberg J, Darnell JE, Jr. The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function. Oncogene 2000; 19(21): 2468-2473

10 Stark GR, Darnell JE, Jr. The JAK-STAT pathway at twenty. Immunity 2012; 36(4): 503-514

11 Bromberg JF, Wrzeszczynska MH, Devgan G, et al. Stat3 as an oncogene. Cell 1999; 98(3): 295-303

12 Zuazo A, Plano D, Ansó E, et al. Cytotoxic and proapototic activities of imidoselenocarbamate derivatives are dependent on the release of methylselenol. Chem Res Toxicol 2012; 25(11): 2479-2489

（2013-07-17收稿）

Methylseleninic acid promotes prostatic cancer LNCap cells apoptosis*

Liu Yanbo1,2, Sun Yuanyuan1, Xu Jie1, Jiao Qiao1, Fei Congcong1, Zhao Xiaohui1, Lu Lili1**, Dong Yan2,3**, Zhao Xuejian2
1. Beihua University Medical College, Jilin 132013, China; 2. Prostate Disease Prevention and Cure Research Center, Jilin University; 3. Tulane University Life Science Research Center, Louisiana USA Corresponding author:Lu Lili, E-mial: lulili313@163.com; Dong Yan, E-mail: drdong71@gmail.com

ObjectiveTo investigate the proapoptotic effects of methylseleninic acid (MSA) on prostatic cancer Lncap cells and explore its mechanism.MethodsThe treated Lncap cells were divided into four groups such as the control group (mock), MSA low-dose group (1.25μM), middle dose group (2.50μM) and high dose group (5.00μM) respectively. Cell morphology was observed with microscope at the time of 24h, 48h and 72h after treatment. Cell proliferation was detected by SRB assay. Cell cycle and apoptosis was measured by flow cytometry. Stat3 expression was detected by immunofl uorescence and immunocytochemical analysis.ResultsLight microscopy observation and SRB results indicated that the growth of Lncap cells were inhibited obviously with MSA dose and time dependent effect. Flow cytometry analysis showed that MSA promoted LNCap cells apoptosis with dose and time dependent effect and changed the cell cycle distribution. The majority of cells were arrested in G0-G1 phase. Immunofl uorescence and immunohistochemistry results showed MSA could inhibit the expression of intracellular stat3 compared with that of the control group.Conclusion MSA might inhibit cell proliferation and induce apoptosis, and its mechanism was associated with decreased stat3 expression.

prostatic neoplasms; methylseleninic acid; apoptosis; stat3 transcription factor

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.01.003

R 737.25

資助: 國家級大學生創新項目（項目編號: 20121020103）;吉林省教育廳“十二五”科學技術研究項目合同書（基教科合字2013191）

**共同通訊作者: 蘆麗莉, E-mial: lulili313@163.com; 董妍,E-mail: drdong71@gmail.com