PTEN能負(fù)調(diào)控前列腺癌PC-3細(xì)胞Raf-1磷酸化

孫健瑋王劍松*劉子超楊峻峰馬 輝鄭立民

1.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科（昆明 650101）; 2.昆明學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)系; 3.昆明醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院泌尿外科

PTEN能負(fù)調(diào)控前列腺癌PC-3細(xì)胞Raf-1磷酸化

孫健瑋1王劍松1*劉子超2楊峻峰1馬 輝1鄭立民3

1.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科（昆明 650101）; 2.昆明學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)系; 3.昆明醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院泌尿外科

目的探討 PTEN基因表達(dá)變化對(duì)Raf-1磷酸化的影響。方法用Western blot方法分別檢測(cè)PTEN基因過(guò)表達(dá)和干擾后前列腺癌PC-3細(xì)胞Raf-1的磷酸化水平。結(jié)果PTEN基因過(guò)表達(dá)后，PC-3細(xì)胞的磷酸化Raf-1 減少61.1%；PTEN基因干擾后，磷酸化Raf-1增加75.1%。結(jié)論P(yáng)TEN可負(fù)調(diào)控前列腺癌PC-3細(xì)胞Raf-1的磷酸化。

PTEN磷酸水解酶; Raf激酶類; 前列腺腫瘤

前列腺癌常見(jiàn)于老年男性，其發(fā)病率近年來(lái)呈明顯上升趨勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國(guó)2012年男性新增前列腺癌患者達(dá)241 740例，占同期男性全部新增癌癥患者總數(shù)的28.5%，位居癌癥新發(fā)病率的首位[1]。由于前列腺癌與雄激素相關(guān)的特性，激素剝奪性治療（androgen deprivation therapy, ADT）被認(rèn)為是前列腺癌有效的治療手段[2-4]。但大多數(shù)病例最終將發(fā)展成為激素非依賴性前列腺癌（androgen independent prostate cancer, AIPC）而對(duì)內(nèi)分泌治療產(chǎn)生抵抗，繼而出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和死亡。

第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphatease and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN）屬于抑癌基因，其表達(dá)水平降低或丟失與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[5]。雄激素受體（androgen receptor, AR）是AIPC發(fā)生發(fā)展進(jìn)程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，并接受多種調(diào)控因子的共同作用而產(chǎn)生生物效應(yīng)[6]。在前列腺癌細(xì)胞中，PTEN可以通過(guò)負(fù)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路影響AR的表達(dá)[7,8]。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase, MAPK）信號(hào)通路是真核細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的重要途徑之一，在基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞質(zhì)功能活動(dòng)中發(fā)揮十分關(guān)鍵的作用。MAPK信號(hào)通路由3類蛋白激酶（Raf-MEK-ERK）組成，通過(guò)一次磷酸化將上游信號(hào)傳遞到下游應(yīng)答分子。最近有研究證明MAPK信號(hào)通路的激活與AIPC的病程進(jìn)展也存在相關(guān)性[9]。然而，PTEN是否與該通路存在關(guān)系還不確定。本研究旨在探討PTEN是否與MAPK信號(hào)通路中Raf1的磷酸化存在關(guān)系，為前列腺癌的臨床診治應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材料

前列腺癌PC-3細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)昆明細(xì)胞庫(kù)；PTEN-pCMV6載體購(gòu)自美國(guó)Origene公司；si-PTEN RNA購(gòu)自Qiagen公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、Lipofectamine RNAiMAX Reagent和Opti-MEM I Medium培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；兔抗PTEN，山羊抗Raf-1和兔抗β-actin抗體購(gòu)自Santa cruz公司，小鼠抗兔和小鼠抗山羊IgG購(gòu)自美國(guó)KPL公司；胎牛血清購(gòu)自Gibco公司。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)液為含10%胎牛血清、10 ng/ml EGF和青鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基，PC-3細(xì)胞在37℃，5% CO2恒溫箱培養(yǎng)基培養(yǎng)，2～3d更換培養(yǎng)液，胰酶消化傳代。取對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

三、細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)加入500 ml對(duì)數(shù)期細(xì)胞懸液（1×105個(gè)/孔），過(guò)夜培養(yǎng)備用。8μg PTEN-pCMV6載體質(zhì)粒和10μl的Lipofectamine 2000分別用250μl的Opti-MEM稀釋，放置5min后混勻，在室溫放置25min后加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中，6h后換成完全培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染48h后用Western Blot檢測(cè)PTEN基因過(guò)表達(dá)程度。并檢測(cè)Raf-1的磷酸化水平。用空質(zhì)粒做對(duì)照。

四、細(xì)胞的干擾

在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)加入500 ml對(duì)數(shù)期細(xì)胞懸液（2×105個(gè)/孔），過(guò)夜培養(yǎng)備用。0.7μl的20 μM si-PTEN RNA及1μl Lipofectamine RNAiMAX分別用5μl的Opti-MEM稀釋放置5min后混勻，在室溫放置18min后加入到24孔板中并加200μl的opti-MEM，6h后換成含完全培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染48h后用Western Blot檢測(cè)PTEN基因干擾程度。并檢測(cè)Raf-1的磷酸化水平。用control siRNA做對(duì)照。

五、Western blot檢測(cè)

各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞用胰酶消化后，加入細(xì)胞裂解液裂解并離心提取蛋白質(zhì)，Bio-rad蛋白定量試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。等量的總蛋白經(jīng)煮沸變性后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，5%奶粉溶液封閉2h，一抗（兔抗PTEN、山羊抗Raf-1和兔抗β-actin抗體）孵育過(guò)夜，二抗（小鼠抗兔和小鼠抗山羊IgG）孵育4h，滴加適量ECL化學(xué)發(fā)光底物，顯影。采用Quantity One軟件測(cè)定條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用配對(duì)樣本分析方法，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、過(guò)表達(dá)PTEN對(duì)Raf-1磷酸化的影響

Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染PTEN-pCMV6載體質(zhì)粒進(jìn)入PC-3細(xì)胞之后，用Western blot技術(shù)測(cè)定PTEN和磷酸化Raf-1的水平，以測(cè)定轉(zhuǎn)染效果和PTEN過(guò)表達(dá)對(duì)Raf-1磷酸化的影響。結(jié)果表明，PTEN過(guò)表達(dá)后磷酸化Raf-1明顯減少（圖1）。灰度分析表明，過(guò)表達(dá)后磷酸化Raf-1減少61.1%（表1）。

表1 過(guò)表達(dá)PTEN對(duì)Raf-1影響的Western 條帶灰度值比較（n=3）

圖1 過(guò)表達(dá)PTEN對(duì)Raf-1磷酸化的影響

二、干擾PTEN對(duì)Raf-1磷酸化的影響

Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染si-PTEN干擾RNA進(jìn)入PC-3細(xì)胞之后，用Western blot技術(shù)測(cè)定PTEN和磷酸化Raf-1的水平，以測(cè)定PTEN干擾效果和干擾后對(duì)Raf-1磷酸化的影響。結(jié)果表明，干擾PTEN后磷酸化Raf-1明顯增加（圖2）。灰度分析表明，干擾PTEN后磷酸化Raf-1增加75.1%（表2）。認(rèn)與AR異常表達(dá)有關(guān)。PTEN是一個(gè)具有磷酸酶活性的抑癌基因，定位于染色體10q23，其編碼蛋白具有磷酸酪氨酸酶和雙重特異性磷酸酶結(jié)構(gòu)域，能使某些磷脂或蛋白激酶的相應(yīng)位點(diǎn)去磷酸化，對(duì)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞的粘附、遷移和分化產(chǎn)生影響[12]。PTEN表達(dá)水平降低或丟失與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，PTEN基因的失活是前列腺癌最常見(jiàn)的異常之一[13]。PTEN基因功能的缺失可能是AIPC進(jìn)展的關(guān)鍵原因[14-16]。PTEN功能缺失可阻止PI3K/AKT通路中PIP3脫磷酸轉(zhuǎn)化為PIP2，從而使AKT持續(xù)激活，提高磷酸化AKT水平，繼而調(diào)控AR的生物效應(yīng)，并抑制通路下游凋亡的信號(hào)分子，促進(jìn)細(xì)胞的增殖[17]。

MAPK/ERK也是前列腺癌發(fā)病機(jī)制中的重要信號(hào)傳導(dǎo)通路之一。PI3K/AKT信號(hào)通路主要與細(xì)胞的存活相關(guān)，而MAPK/ERK則主要與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化有關(guān)[18,19]。MAPK/ERK信號(hào)通路的激活始于細(xì)胞膜上的絲裂原受體激活，以高度保守的三級(jí)激酶級(jí)聯(lián)傳遞信號(hào)，MAPK以及多種應(yīng)激原可以不同的啟動(dòng)機(jī)制激活該信號(hào)通路。MAPK/ERK信號(hào)通路中Raf分為A-raf、B-raf和C-raf-1，其中C-raf-1表達(dá)產(chǎn)物為Raf1蛋白激酶，其CR1保守區(qū)即為活化Ras的結(jié)合部位。Ras作為通路的啟動(dòng)信號(hào)，其激活后可將Raf1聚集到細(xì)胞膜并結(jié)合其他相關(guān)蛋白導(dǎo)致Raf1的磷酸化，磷酸化的Raf1通過(guò)其下游因子MAPK激酶（MEK1/2）和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK1/2）完成胞漿蛋白磷酸化、細(xì)胞骨架成分磷酸化以及胞核轉(zhuǎn)錄因子、核蛋白磷酸化等而實(shí)現(xiàn)其生物效應(yīng)。在前列腺癌，Ras和Raf的激活是自分泌和旁分泌生長(zhǎng)因子刺激的結(jié)果，Ras持續(xù)激活可推進(jìn)AIPC的病程進(jìn)展[13]，MAPK/ERK信號(hào)通路在前列腺癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[20]。

PTEN是否與MAPK/ERK信號(hào)通路存在聯(lián)系是本研究想要探討的問(wèn)題。磷酸化Raf1是MAPK/ ERK信號(hào)通路中三級(jí)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的第一級(jí)，起著分子開(kāi)關(guān)的作用，是聯(lián)系細(xì)胞外信號(hào)與細(xì)胞內(nèi)激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示PTEN基因表達(dá)與前列腺癌PC-3細(xì)胞Raf-1磷酸化呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，有助于揭示前列腺癌的發(fā)生機(jī)制并可針對(duì)PTEN、Raf1以及MEK等信號(hào)通路中關(guān)鍵因子作為靶點(diǎn)進(jìn)行治療干預(yù)。PTEN蛋白對(duì)Raf1磷酸化的具體作用機(jī)制以及磷酸化Raf1對(duì)AIPC有何影響，有待進(jìn)一步研究。

圖2 干擾PTEN對(duì)Raf-1磷酸化的影響

表2 干擾PTEN對(duì)Raf-1影響的Western條帶灰度值比較（n=3）

討 論

前列腺癌是近年老年男性發(fā)病率較高的癌癥之一，對(duì)前列腺癌的發(fā)病機(jī)制及其治療手段研究也是當(dāng)前癌癥研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。絕大多數(shù)早期前列腺癌都與雄激素的異常表達(dá)有關(guān)，因此，早期前列腺癌治療多用抗雄激素治療的方法[10]。然而，大量前列腺癌后期都表現(xiàn)為激素非依賴性（即AIPC），導(dǎo)致抗雄激素治療無(wú)效。

AIPC發(fā)病機(jī)制尚待研究，AR在其細(xì)胞增殖、分化以及發(fā)生發(fā)展中的重要作用備受關(guān)注。作為核轉(zhuǎn)錄因子，AR結(jié)合相關(guān)配體可激活一系列活性蛋白轉(zhuǎn)錄參與細(xì)胞的增殖、凋亡等。大多數(shù)AIPC表現(xiàn)有AR的擴(kuò)增或過(guò)表達(dá)，繼而導(dǎo)致對(duì)低水平雄激素的敏感性增加，或經(jīng)由AR傳遞的信號(hào)通路激活，可能是AIPC產(chǎn)生的機(jī)制之一[11]。

酪氨酸激酶受體通路是眾多與AR信號(hào)通路發(fā)生交互作用的信號(hào)通路之一，主要包括PI3K/AKT和MAPK/ERK等。其中PI3K/AKT信號(hào)通路已經(jīng)被確

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（2013-11-11收稿）

PTEN downregulates in the level of Raf-1 phosphorylation in prostate cancer cell PC-3

Sun Jianwei1, Wang Jiansong1*, Liu zichao2, Yang Junfeng1, Ma Hui1, Zheng Limin3
1.Department of Urology, the Second Affi liated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650101, China; 2. Department of Biologican Science and Technology, Kunming University; 3. Department of Urology, the Fifth Affi liated Hospital of Kunming Medical University Corresponding author: Wang Jiansong, E-mail: Jiansongwang@yahoo.com

ObjectiveTo investigate the effects of PTEN expression on level of Raf-1 phosphorylation in prostate cancer cells.MethodsThe level of Raf-1 phosphorylation was detected by western blot in prostate cancer cells with PTEN gene overexpression or PTEN gene knockdown.ResultsThe level of Raf-1 phosphorylation decreased by 61.1% in PC-3 cells with PTEN gene overexpression, and increased by 75.1% in PC-3 with PTEN gene silence.ConclusionPTEN can downregulate the level of Raf-1 phosphorylation.

PTEN Phosphohydrolase; Raf Kinases; prostatic neoplasms

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.01.005

R 737.25

*通訊作者, E-mail: Jiansongwang@yahoo.com