RNA干擾PPT1基因表達(dá)對(duì)小鼠Sertoli細(xì)胞功能的影響*

周婉格周 任王統(tǒng)菲應(yīng) 倩李 倩劉 悅丁之德

1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 2009級(jí)臨床醫(yī)學(xué)八年制（上海 200025）;

2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系

RNA干擾PPT1基因表達(dá)對(duì)小鼠Sertoli細(xì)胞功能的影響*

周婉格1周 任1王統(tǒng)菲1應(yīng) 倩1李 倩1劉 悅2**丁之德2**

1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 2009級(jí)臨床醫(yī)學(xué)八年制（上海 200025）;

2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系

目的探索PPT1基因在小鼠支持細(xì)胞（Sertoli細(xì)胞）中的功能。方法采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)小鼠Sertoli細(xì)胞株TM4中PPT1基因的表達(dá)，并運(yùn)用MTS法檢測(cè)細(xì)胞活力，Annexin V染色結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Mito Tracker Red染料染色細(xì)胞，并在激光共聚焦顯微鏡下觀察線粒體且測(cè)得熒光強(qiáng)度以檢測(cè)線粒體活性，透射電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果抑制小鼠TM4細(xì)胞中PPT1基因的表達(dá)可降低其細(xì)胞活力和線粒體活性，導(dǎo)致線粒體超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，并增加細(xì)胞凋亡率。結(jié)論P(yáng)PT1基因?qū)S持小鼠Sertoli細(xì)胞的功能具有重要作用。

RNA干擾; 棕櫚酰蛋白硫酯酶1（PPT1）; 塞爾托利細(xì)胞（Sertoli）; 線粒體; 細(xì)胞凋亡

肥胖是一種嚴(yán)重的慢性病，可以引起包括心血管疾病，Ⅱ型糖尿病，高血壓，癌癥以及不育癥[1,2]在內(nèi)的許多健康問題。最近的研究數(shù)據(jù)表明在美國(guó)有超過35%的男性有肥胖問題（即BMI≥30 kg/m2）[3,4]。另一方面，目前在我國(guó)的適齡生育夫婦中，據(jù)統(tǒng)計(jì)有12.5%的夫婦患有不孕和不育，患者總數(shù)已超過4000萬，其中由男性因素引起的不育約占一半左右，男性不育癥的發(fā)病率呈快速上升趨勢(shì)。近期的流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)：肥胖與男性不育癥的發(fā)生密切相關(guān)[5-7]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)肥胖可致雄性不育[8-10]。然而，迄今為止，肥胖所致雄性不育的研究都基于現(xiàn)象的描述，涉及其分子機(jī)制的研究很少。

前期研究中，我們構(gòu)建了高脂飲食引起的肥胖大鼠動(dòng)物模型，運(yùn)用蛋白組學(xué)技術(shù)從雄性肥胖大鼠的睪丸蛋白中篩選出若干差異蛋白。發(fā)現(xiàn)棕櫚酰蛋白硫酯酶-1（Palmitoyl protein thioesterase-1，PPT1）在肥胖大鼠睪丸組織中的表達(dá)明顯升高；間接免疫熒光分析結(jié)果顯示，PPT1主要定位于生精小管的Sertoli細(xì)胞和部分生精細(xì)胞；體外加入脂類物質(zhì)如膽固醇、游離脂肪酸等可引起大鼠睪丸支持細(xì)胞（Sertoli細(xì)胞）的PPT1表達(dá)量顯著增加。在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過體外RNA干擾技術(shù)下調(diào)小鼠Sertoli細(xì)胞株TM4中PPT1基因的表達(dá)，進(jìn)而檢測(cè)其對(duì)TM4細(xì)胞各項(xiàng)功能性指標(biāo)的影響，從而進(jìn)一步了解PPT1基因的功能。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

小鼠Sertoli細(xì)胞株TM4細(xì)胞（由上海市生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供）。

二、主要試劑與儀器

（一）試劑

PPT1 shRNA表達(dá)質(zhì)粒（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供）、DMEM培養(yǎng)液（Hyclone）、抗生素G418（Sigma）、質(zhì)粒抽提試劑盒（Takara）、無內(nèi)毒素大抽質(zhì)粒試劑盒（Omega）、轉(zhuǎn)染試劑FugENE HD（Roche）、Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（Calbiochemistry）、MTS細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒（Promega）、兔抗PPT-1抗體（Abgent）、羊抗兔HRP抗體（Abgent）。

（二）儀器

無菌操作臺(tái)（SANYO），恒溫培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific），PCR儀（Ependorf），熒光定量PCR儀（Applied Biosystems 7500），流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson），透射電鏡（Philips CM-120），激光共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss LSM510），熒光光譜儀（PERKIN ENMER LS50）。

三、方法

（一）細(xì)胞培養(yǎng)、RNA干擾和熒光定量PCR

小鼠Sertoli細(xì)胞株TM4細(xì)胞以DMEM高糖培養(yǎng)液（含10% 胎牛血清）培養(yǎng)。

以PPT1基因序列GCAAGCACAGTACTGGCA TGA為靶序列設(shè)計(jì)shRNA引物，并從小鼠cDNA文庫中擴(kuò)增該序列。將shRNA片段克隆到目的表達(dá)載體后，經(jīng)測(cè)序無誤，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)大腸桿菌。按照無內(nèi)毒素大抽質(zhì)粒說明書進(jìn)行質(zhì)粒抽提。

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TM4細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前1d，將細(xì)胞傳代至6孔板中，細(xì)胞密度約105/mL。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將2 μg質(zhì)粒與100 μL無血清的DMEM培養(yǎng)液柔和混勻，加入8 μL FuGENE轉(zhuǎn)染試劑，混勻，室溫靜置20 min后加入各孔細(xì)胞培養(yǎng)液中。37℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后更換為含400 μg/mL G418的DMEM培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)7d，從而獲得穩(wěn)定表達(dá)shRNA的TM4細(xì)胞。

熒光定量PCR檢測(cè)：以5’ GGGAAGAACATGA TGGAGGAT 3’和5’ CTGGGAGAAGCCAATAGCA 3’為引物，采用Takara SYBR Green Realtime PCR試劑和ABI 7500熒光定量PCR儀檢測(cè)PPT1基因表達(dá)情況。每組細(xì)胞PPT1及內(nèi)參GAPDH各重復(fù)4次。隨后，運(yùn)用2-ΔΔCT法（Livak法）分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

（二）細(xì)胞活力檢測(cè)

采用MTS細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒，每500 μL細(xì)胞培養(yǎng)液中加入100 μL MTS試劑，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育60min，吸取200μL培養(yǎng)液置于96孔酶標(biāo)板中，檢測(cè)A490吸光值，從而判斷細(xì)胞活力。

（三）線粒體熒光染色

Mito Tracker Red染料以DMEM培養(yǎng)液稀釋至1 μg/ mL，與細(xì)胞孵育30 min。PBS洗去染色液。在激光共聚焦顯微鏡下觀察，熒光生物發(fā)光儀測(cè)量熒光強(qiáng)度。

（四）線粒體電鏡觀察

TM4細(xì)胞以電鏡固定液，4℃固定過夜。組織處理、包埋、切片及透射電鏡檢測(cè)由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化與分子細(xì)胞系電鏡室完成，主要觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)變化。

（五）細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，具體操作如下：細(xì)胞消化為懸液，各組分別取500 μL細(xì)胞懸液，加入10 μL Media Binding Reagent, 隨后加1.25 μL Annexin V，室溫避光孵育20min，離心5 min吸去上清，加500 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，置于冰上，進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。

結(jié) 果

一、shRNA對(duì)TM4細(xì)胞PPT1基因表達(dá)的抑制

通過熒光定量PCR方法在mRNA水平檢測(cè)了RNA干擾對(duì)細(xì)胞PPT1基因表達(dá)的影響，結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組（RNA干擾組）PPT1mRNA表達(dá)量是對(duì)照組（非RNA干擾組）的8.4%（圖1A），即通過RNA干擾實(shí)驗(yàn)可以抑制TM4細(xì)胞中91.6%的PPT1基因mRNA表達(dá)。

二、shRNA對(duì)TM4細(xì)胞活力的影響

細(xì)胞增殖/活力檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力顯示：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力（A490：1.13±0.03）相對(duì)于對(duì)照組細(xì)胞活力（A490：1.46±0.03）顯著下降（n = 6，P＜0.01）（圖1B）。

三、shRNA對(duì)TM4 細(xì)胞凋亡的影響

運(yùn)用Annexin V染色結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率顯示：實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率為（19.07 ±6.33）%，而對(duì)照組細(xì)胞凋亡率僅為（9.68± 5.22）%，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組細(xì)胞凋亡率顯著增加（n = 5，P＜0.05）（圖1C）。

四、shRNA對(duì)TM4細(xì)胞線粒體活性的影響

Mito Tracker Red可對(duì)細(xì)胞活性線粒體進(jìn)行熒光染色。在激光共聚焦顯微鏡下觀察顯示：正常TM4細(xì)胞線粒體具有良好的熒光染色，而表達(dá)綠色熒光蛋白的實(shí)驗(yàn)組TM4細(xì)胞線粒體熒光強(qiáng)度減弱（圖2A），表明RNA干擾抑制PPT1表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞線粒體活性下降。進(jìn)一步采用熒光生物發(fā)光儀檢測(cè)顯示：實(shí)驗(yàn)TM4細(xì)胞線粒體熒光強(qiáng)度（77.14±14.22）較對(duì)照組（120.75 ±10.20）顯著降低（n= 6，P＜0.01）（圖2B）。

五、shRNA對(duì)TM4細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響

運(yùn)用透射電鏡觀察TM4細(xì)胞線粒體的超微結(jié)構(gòu)顯示：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞線粒體呈明顯的空泡化且線粒體嵴消失（圖3）。

圖1 TM4細(xì)胞PPT1 RNA干擾后細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡的比較

圖2 PPT1 RNA干擾組和對(duì)照組線粒體熒光強(qiáng)度比較

圖3 RNA干擾TM4細(xì)胞PPT1表達(dá)后線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化

討 論

棕櫚酰化是一種重要的蛋白翻譯后修飾形式，目前已知有100多種蛋白質(zhì)發(fā)生棕櫚酰化修飾，賦予蛋白重要的生物學(xué)功能[11,12]。棕櫚酰化蛋白在降解和回收利用過程中，需要去除棕櫚酰修飾。這一工作由PPT1在溶酶體中完成[9]。PPT1功能缺失會(huì)造成神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥[13,14]及膽固醇代謝的異常[15,16]。在生精上皮中，Sertoli細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)富含溶酶體并在精子發(fā)生過程中扮演了極為重要的角色，構(gòu)成了生精細(xì)胞發(fā)育成熟的微環(huán)境。

實(shí)驗(yàn)中，我們運(yùn)用RNA干擾技術(shù)成功抑制小鼠Sertoli細(xì)胞株TM4中PPT1基因的表達(dá)，基因沉默效率達(dá)到91.6%。在此基礎(chǔ)上，我們檢測(cè)了細(xì)胞活力的變化。運(yùn)用MTS試劑處理細(xì)胞后測(cè)A490吸光值的方法可測(cè)量細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)組的A490吸光值是1.13± 0.03，而對(duì)照組為1.46±0.03，表明RNA干擾PPT1基因會(huì)使TM4細(xì)胞活力顯著下降。

線粒體為一雙層膜圍成的囊狀結(jié)構(gòu)，由內(nèi)膜、外膜、外室、基質(zhì)構(gòu)成，存在于內(nèi)膜的質(zhì)子泵將基質(zhì)內(nèi)質(zhì)子泵入外室，從而形成內(nèi)負(fù)外正的線粒體跨膜電位（△ψm）。△ψm對(duì)維持線粒體正常功能是必要的[17]，它的存在使一些正電荷熒光染料，如JC-1、CMX ROS可結(jié)合到線粒體基質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)中用的Mito Tracker Red染料對(duì)線粒體的染色效果與△ψm有關(guān)，而△ψm又可以反映線粒體的活性，因而可以用熒光的強(qiáng)度代表線粒體活性。熒光染色結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組TM4細(xì)胞線粒體熒光強(qiáng)度相對(duì)于對(duì)照組而言顯著降低，表明實(shí)驗(yàn)組影響了細(xì)胞線粒體活性。另外，透射電鏡結(jié)果也顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞線粒體呈空泡化且線粒體嵴消失。這兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)都表明RNA干擾PPT1基因會(huì)影響細(xì)胞線粒體的結(jié)構(gòu)和功能。

線粒體的結(jié)構(gòu)和功能與細(xì)胞凋亡有著密切的聯(lián)系。在細(xì)胞凋亡早期，線粒體會(huì)出現(xiàn)內(nèi)膜通透性增加、跨膜電位降低 、Ca2+攝入等改變。這些改變可導(dǎo)致線粒體通透孔道的開放和線粒體促凋亡蛋白釋放[18]，引起caspase非依賴的細(xì)胞凋亡[19]；還可導(dǎo)致凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）、細(xì)胞色素C（cyt-c）、凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）的釋放，激活caspase依賴的細(xì)胞凋亡途徑[20]。

由于RNA干擾PPT1基因可使TM4細(xì)胞的線粒體結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，而細(xì)胞線粒體的結(jié)構(gòu)和功能直接影響細(xì)胞的凋亡過程，因此我們猜測(cè)RNA干擾PPT1同樣能使TM4細(xì)胞的凋亡增加。運(yùn)用Annexin V細(xì)胞染色結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)顯示，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率為19.07%，而對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為9.68%，實(shí)驗(yàn)組相比對(duì)照組TM4細(xì)胞凋亡顯著增加，從而驗(yàn)證了我們的猜測(cè)。

綜上所述，運(yùn)用RNA干擾技術(shù)可使Sertoli細(xì)胞株TM4的PPT1基因沉默并造成細(xì)胞活力減退，細(xì)胞凋亡增加，線粒體活力以及超微結(jié)構(gòu)改變，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分表明了PPT1基因?qū)τ诰S持細(xì)胞活力和抑制細(xì)胞凋亡具有重要作用。

1 Adams JP, Murphy PG. Obesity in anaesthesia and intensive care.Br J Anaesth2000; 85(1): 91-108

2 Practice Committee of American Society for Reproductive Medicine. Obesity and reproduction: an educational bulletin.Fertil Steril2008; 90(5 Suppl): S21-S29

3 Flegal KM, Carroll MD, Kit BK,et al. Prevalence ofobesity and trends in the distribution of body mass index among US adults, 1999-2010.JAMA2012; 307(5): 491-497

4 Cabler S, Agarwal A, Flint M,et al. Obesity: modern man's fertility nemesis.Asian J Androl2010; 12(4): 480-489

5 Pasquali R, Patton L, Gambineri A. Obesity and infertility.Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes2007; 14(6): 482-487

6 Kort HI, Massey JB, Elsner CW,et al. Impact of body mass index values on sperm quantity and quality.J Androl2006; 27(3): 450-452

7 Hammoud AO, Gibson M, Peterson CM,et al. Obesity and male reproductive potential.J Androl2006; 27(5): 619-626

8 Bakos HW, Mitchell M, Setchell BP,et al.The effect of paternal diet-induced obesity on sperm function and fertilization in a mouse model.Int J Androl2011; 34(5 Pt 1): 402-410

9 Ghanayem BI, Bai R, Kissling GE,et al. Diet-induced obesity in male mice is associated with reduced fertility and potentiation of acrylamide-induced reproductive toxicity.Biol Reprod2010; 82(1): 96-104

10 Arsov T, Silva DG, O'Bryan MK,et al. Fat aussie-A new alstr?m syndrome mouse showing a critical role for ALMS1 in obesity, diabetes, and spermatogenesis.Mol Endocrinol2006; 20(7):1610-1622

11 Rocks O, Gerauer M, Vartak N,et al. The palmitoylation machinery is a spatially organizing system for peripheral membrane proteins.Cell2010; 141(3): 458-471

12 Fukata Y, Fukata M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity.Nat Rev Neurosci2010; 11(3): 161-175

13 Ramadan H, Al-Din AS, Ismail A,et al. Adult neuronal ceroid lipofuscinosis caused by def ciency in palmitoyl protein thioesterase 1.Neurology2007; 68(5): 387-388

14 Takano K, Shimono M, Shiota N,et al. Infantile neuronal ceroid lipofuscinosis: the first reported case in Japan diagnosed by palmitoyl-protein thioesterase enzyme activity def ciency.Brain Dev2008; 30(5): 370-373

15 Ahtiainen L, Kolikova J, Mutka AL,et al. Palmitoyl protein thioesterase 1 (Ppt1)-deficient mouse neurons show alterations in cholesterol metabolism and calcium homeostasis prior to synaptic dysfunction.Neurobiol Dis2007; 28(1): 52-64

16 Lyly A, Marjavaara SK, Kytt?l? A,et al. Def ciency of the INCL protein Ppt1 results in changes in ectopic F1-ATP synthase and altered cholesterol metabolism.Hum Mol Genet2008; 17(10): 1406-1417

17 Kroemer G, Zamzami N, Susin SA. Mitochondrial control of apoptosis.Immunol Today1997; 18(1): 44-51

18 Norberg E, Gogvadze V, Ott M,et al. An increase in intracellular Ca2+is required for the activation of mitochondrial calpain to release AIF during cell death.Cell Death Differ2008; 15(12): 1857-1864

19 Norberg E, Orrenius S, Zhivotovsky B. Mitochondrial regulation of cell death: Processing of apoptosis-inducing factor (AIF).Biochem Biophys Res Commun2010; 396(1): 95-100

20 Reed JC. Cytochrome c: Can’t live with it-can’t live without it.Cell1997; 91(5): 559-562

（2013-11-11收稿）

The influence of PPT1 gene expression by RNA interference on Sertoli cells of mice*

Zhou Wange1, Zhou Ren1, Wang Tongfei1, Ying Qian1, Li Qian1, Liu Yue2**, Ding Zhide2**
1. Department of Clinical Medicine, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200025, China; 2. Department of Human Anatomy, Histology and Embryology, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University

Liu Yue, E-mail: liuyue@shsmu.edu.cn; Ding Zhide, E-mail: zding@shsmu.edu.cn

ObjectiveTo investigate the function ofPPT1gene in mose sertoli cells.MethodsThe expression ofPPT1gene in Sertoli cell line TM4 was inhibited using RNAi technique. Viability of transfected cells was measured by MTS. Meanwhile, cell apoptosis was detected by Flow Cytometry. The cells were stained by Mito Tracker Red and their mitochondrial activity was observed under the laser scanning confocal microscope.The ultrastructure of cell mitochondria was observed by transmission electron microscopy (TEM).ResultsThe inhibition ofPPT1gene expression decreased cell viability and mitochondrial activity, and resulted in the ultrastructural changes of the mitochondria as well as enhanced cell apoptosis rate.ConclusionPPT1plays a critical role in maintaining the structure and function of Sertoli cells.

RNA interference; palmitoyl protein thioesterase 1; Sertoli cells; mitochondria; apoptosis

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.04.002

R 698.2

資助: 第五期上海市大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目和第五期上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（編號(hào): 2011025）

**共同通訊作者: 劉悅, E-mail: liuyue@shsmu.edu.cn; 丁之德, E-mail: zding@shsmu.edu.cn