輔助生殖技術中Zn2+抑制精子DNA碎片形成*

吳金香王正堯謝遠志蔡俊峰

1. 福建醫科大學附屬第二醫院檢驗科（泉州 362000）; 2. 福建醫科大學附屬第二醫院生殖男科

輔助生殖技術中Zn2+抑制精子DNA碎片形成*

吳金香1**王正堯1謝遠志2蔡俊峰1

1. 福建醫科大學附屬第二醫院檢驗科（泉州 362000）; 2. 福建醫科大學附屬第二醫院生殖男科

輔助生育技術（assisted reproductive technology，ART）已成為治療不孕癥患者的主要治療方法之一，因此保證輔助生殖成功以實現優生優育是非常重要的。ART中精子體外優選處理、冷凍及復蘇過程中導致的精子氧化損傷影響著精液常規的各項指標[1]。Zn2+是男性體內精子生長發育過程中不可缺少的微量元素。大量研究表明[2-4]，體內Zn2+具有抗氧化作用，然而ART中Zn2+能否保護精子受氧化刺激的損傷作用，目前尚無研究，本研究在優選后的精子中加入適量的Zn2+，通過比較精子的存活率、活力以及精子DNA碎片檢測判斷Zn2+能否抑制H2O2的氧化損傷精子DNA作用，旨在判斷ART中Zn2+能否抑制精子DNA碎片的形成。

材料和方法

一、材料

10例正常健康男性精液樣品，取自本院有生育能力的青年自愿者，年齡25～30（26±2）歲。ZnCL2為瑞士Adamas-beta公司產品。30% H2O2由西隴化工股份有限公司提供。40%上層梯度離心液，80%下層梯度離心液,洗精液均為美國Quinn's公司產品。精子DNA碎片檢測試劑盒購于深圳博銳德生物科技有限公司。精子質量分析系統為北京國聯醫療技術有限公司產品。 OLYMPUS.CX31型光學顯微鏡為日本OLYMPUS公司生產。

二、方法

本研究設計不同濃度梯度的H2O2（0.1%，0.01%和0.001%）和Zncl2（50 nmol/L，25 nmol/L，12.5 nmol/L，6.2 nmol/L），應用國聯精子檢測系統檢測精子的存活率和活力來選擇最佳的干預濃度為0.001% H2O2和12.5 nmol/L Zncl2。10份正常精液標本，置37℃水浴箱待液化，分別用40%和80%高密度離心液制備梯度液，300×g，15min獲取優質精子，Quinn’s洗精液300×g，5min洗滌優質精子2次后將精子密度至5～10×109/L，每份0.3mL平均分為3組：實驗組（Zncl2+H2O2）組含12.5 nmol/L Zncl2及0.001%的H2O2；H2O2組含0.001% H2O2；空白組加入等體積0.9%NaCl2。3組同時置37℃、5%CO2孵箱中孵育5h和24h后分析不同實驗組之間的差異。

1. 精子活力與存活率的分析：3組同時置37℃，5% CO2孵箱中孵育5h和24h后，用國聯精子檢測系統觀察精子運動功能的變化，從而判斷精子的存活率與活力。

2. 精子DNA碎片的檢測：本實驗采用精子染色質擴散法進行檢測：3組實驗分別取60μl參照精子DNA檢測試劑盒說明書進行操作。DNA完整的精子在經過變性和去掉核蛋白后DNA擴散形成特征性的光暈，而存在DNA碎片的精子不會產生這種特征性的光暈。根據光暈的有無和大小判斷精子DNA的完整程度。精子DNA碎片判斷標準：精子頭部僅產生較小的光暈或無光暈，單側光暈的厚度不超過精子頭部最小直徑的1/3，（如圖1）。隨機選取視野觀察（×400倍），計數500個精子，按以下公式計算出存在DNA碎片精子百分率：

圖1 精子DNA碎片檢測示意圖

3. 應用SPSS 20.0軟件進行統計分析，多組的均數比較采用隨機區組設計的方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，雙側檢驗，P＜0.05認為差異有統計學意義。

結 果

一、Zn2+對受H2O2影響精子活力與存活率的保護作用

10例正常健康男性精液經ART中精液優化處理后在H2O2作用下精子運動能力顯著下降，明顯低于同時加入適量Zncl2的實驗組，差異比較均具統計學意義（P＜0.001），見表1。

表1 Zn2+對H2O2影響優選后精子活力和存活率的保護作用（n=10，±s，%）

表1 Zn2+對H2O2影響優選后精子活力和存活率的保護作用（n=10，±s，%）

5h后 24h后活力 存活率 活力 存活率空白組 84.25 94.2 78.61 92.14 H2O2組 3.43 23.24 0 0實驗組 26.14 61.32 0.79 6.35

二、Zn2+對H2O2影響精子損傷DNA的抑制作用

10例正常健康男性精液經ART中精液優化處理后在H2O2刺激下精子DNA完整性嚴重破壞，DNA損傷程度明顯高于同時加入適量Zncl2的實驗組，差異比較均具統計學意義（P＜0.001），結果見圖2。

圖2 3組精子DNA損傷程度比較

討 論

男性不育占不育癥30%，常見的病因有生殖系炎癥、精索靜脈曲張、無精子癥、畸形精子等。精子DNA碎片化是近幾年的研究熱點，其形成是導致男性不孕的主要原因之一，是精子DNA損傷的一種表現，與精子細胞凋亡密切相關[5,6]。男性精子DNA碎片化的形成造成精子內部遺傳信息的不完整，嚴重影響生育情況，會導致不孕、反復流產和胎兒畸形，造成胎兒發育停滯和輔助生殖失敗等[7,8]。因此如何避免精子DNA碎片化的形成是目前的研究熱點。目前國內外大量的研究表明：精子DNA碎片化形成可能與炎癥、凋亡、氧化損傷以及環境因素等多種因素作用相關[5-8]。

ART已成為不孕癥患者的主要治療方法之一，因此保證輔助生殖成功以實現優生優育是非常重要的。ART已經發展30多年，盡管ART可以促進精液液化，通過各種方法去除精液中的白細胞、死精子以及部分畸形精子等，從而達到精子優選的目的，但仍無法去除DNA碎片化的精子，且ART中存在造成精子DNA碎片化的可能因素，比如精子優選方法選擇、精子優選過程中離心力和離心時間的選擇、優選后精子的培養時間以及精子的冷凍與復蘇等[9,10]，因此降低精子優選過程中精子DNA碎片，提高體外輔助受孕率和優生優育率是非常必要的，但目前尚無這方面的研究。

目前國內外多數研究停滯于精子DNA碎片化的檢測方法學以及臨床意義的研究，其形成的確切機制以及預防措施方面的研究不多。Villani等[6]研究者認為精子DNA碎片化形成是導致精子凋亡的前期表現，而細胞凋亡與DNase和caspases密切相關。活性氧（reactive oxygen species，ROS）是細胞正常代謝產生的有毒物質，ROS增加影響精子質量以及精子DNA完整性，從而導致不孕、反復流產和胎兒畸形等。ROS及炎癥刺激等激活精子細胞內DNase和caspases系統，從而降解精子DNA導致精子DNA損傷引起精子凋亡，因此研究者認為精子DNA碎片化形成與DNase的活化以及caspases系統的激活相關[6,11]。Sibirtsev等[11]應用H2O2和DNase對人、老鼠和公牛3個物種的精子進行處理研究，結果表明3個物種精子DNA碎片損傷與過氧化氫和DNase酶密切相關，而人的精子對DNase酶的敏感性最高。Sibirtsev等[11]研究Ca2+，Mg2+依賴的DNase在中間球海膽（Sea Urchin Strongylocentrotus intermedius）精子中的活化并激活caspases系統降解精子DNA的機制，并指出Zn2+可以阻斷DNase的降解中間球海膽精子DNA的作用，從而減少中間球海膽精子DNA碎片的作用。

Zn2+在睪丸生精過程中具重要的作用，是男性體內精子生長發育過程中不可缺少的微量元素。目前尚無學者研究Zn2+是否在體外ART中的預防和減少精子DNA碎片形成的作用。本研究采用ART中優選的精子為實驗對象，以H2O2為氧化刺激物，通過精子DNA碎片的檢測結合國聯軟件系統分析并比較精子的活率、活力，判斷Zn2+能否抑制H2O2對精子的氧化損傷作用。實驗結果表明，在ART中H2O2可明顯損傷精子DNA的作用，適量的Zn2+能明顯減少H2O2對人類精子的DNA碎片，從而保護精子DNA的完整性，為ART以及優生優育提供實驗依據。另外在本研究中發現體外培養基中Zn2+濃度遠低于精漿中的Zn2+濃度，主要是Zn2+在體內不同部位的濃度分布不一，ART中應用的培養基主要是參照輸卵管液，可見在輸卵管位置Zn2+的量明顯少于精漿。

精子; DNA碎片裂; 生殖技術, 輔助

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4 Kotdawala AP, Kumar S, Salian SR,et a1. Addition of zinc to human ejaculate prior to cryopreservation prevents freeze-thaw-induced DNA damage and preserves sperm function.J Assist Reprod Genet2012; 29(12): 1447-1453

5 Zhang HB, Lu SM, Ma CY,et a1. Early apoptotic changes in human spermatozoa and their relationships with conventional semen parameters and sperm DNA fragmentation.Asian J Androl2008; 10(2): 227-235

6 Villani P, Eleuteri P, Grollino MG,et a1. Sperm DNA fragmentation induced by DNAse I and hydrogen peroxide: an in vitro comparative study among different mammalian species.Reproduction2010; 140(3): 445-452

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11 Sibirtsev JT, Shastina VV, Menzorova NI,et a1. Sperm DNA fragmentation induced by DNAse I and hydrogen peroxide: an in vitro comparative study among different mammalian species.Mar Biotechnol(NY)2011; 13(3): 536-543

（2014-04-05收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.08.012

R 698.2

資助: 福建省衛生廳青年科研基金資助項目（NO.2011-1-36）**

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