中藥白疕合劑對銀屑病樣動物模型影響的實驗研究

盧益萍 李忻紅 馬賢德 董靈玉

銀屑病是一種由多基因遺傳決定的、多環境因素刺激誘導的免疫異常性慢性炎癥性增生性皮膚?。?］?，F代研究證實，炎癥細胞浸潤、微血管改變及表皮角質形成細胞的過度增殖為銀屑病病理改變的三個特征［2］。從表皮細胞增殖及微血管角度進行銀屑病機制研究是目前研究熱點，本研究通過建立銀屑病樣實驗動物模型從血清中環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)含量、環磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)含量、cAMP/cGMP 比值及血管內皮生長因子(vascular endothelial growh factor，VEGF)水平方面，研究中藥白疕合劑治療銀屑病的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品及主要試劑

白疕合劑(院內自制中藥濃縮煎劑，制劑號:Z05010105，主要組成:丹參15 g、地黃20 g、赤芍20 g、山豆根20 g、板藍根20 g、金銀花30 g、白茅根20 g、白花蛇舌草30 g、全蝎10 g、黃柏20 g);消銀顆粒(陜西康惠制藥股份有限公司，批號:Z20000019，組成:地黃、牡丹皮、當歸、苦參、金銀花、玄參、牛蒡子、蟬蛻、白鮮皮、防風、大青葉、紅花);cAMP、cGMP 酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測試劑盒(上海越研生物科技有限公司提供，批號201210);VEGF ELISA檢測試劑盒(晶美生物工程有限公司提供)。5%鹽酸普萘洛爾乳劑(純鹽酸普萘洛爾原料藥由天津力生制藥股份有限公司提供，批號H12020151，乳劑基質由沈陽市日用化工廠提供，取鹽酸普萘洛爾原料藥加入基質中配制)。

1.2 動物

健康豚鼠60 只，體重(300±30)g，雄雌各半，購自大連醫科大學，動物許可證號:SCXK(遼)2008-0002，分籠飼養于實驗動物中心實驗室。

1.3 儀器

電子天平(上海精密科學儀器有限公司生產)、電熱恒溫培養箱(上海躍進醫療器械廠生產)、低溫高速離心機(德國HERAEUS 生產)、酶標儀(奧地利Anthos Labtec Instruments 生產)。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗分組 健康豚鼠，采用隨機數字表法隨機分為6 組:(1)正常組;(2)模型組、(3)白疕合劑低劑量組;(4)白疕合劑中劑量組;(5)白疕合劑高劑量組;(6)消銀顆粒組。

1.4.2 動物造模 先脫去豚鼠背毛，約4 cm×4 cm大小，3 天后開始實驗。對照組脫毛處僅外涂乳劑基質，其余各組均外涂5%鹽酸普萘洛爾乳劑，范圍約3 cm×3 cm(1 cm×1 cm 用藥0.3 g)，2 次/天，連續3周。造模成功，造成豚鼠背部的銀屑病樣動物模型。

1.4.3 用藥 灌胃量4 ml/只，白疕合劑用藥量(成人每日100 ml/70 kg)，按照人與豚鼠體表面積比例進行換算，計算得出豚鼠給藥劑量為每天7.74 ml/kg，以此濃度設定為中劑量組，低劑量組給藥劑量為3.87 ml/kg，高劑量組給藥劑量為15.48 ml/kg。陽性對照組按人鼠等效劑量灌胃，消銀顆粒組為0.81 g/kg。正常組與模型組豚鼠每日以等量生理鹽水灌胃。

1.4.4 ELISA 法檢測對血清cAMP、cGMP 的含量及比值的影響 上述豚鼠未處死前取血，離心2000 r/min，取血清，采用酶聯免疫試劑盒，按試劑盒說明書要求進行檢測光密度，根據標準曲線計算結果，根據結果計算cAMP/cGMP 比值。

1.4.5 ELISA 法檢測對血清血管內皮生長因子水平的影響 上述豚鼠未處死前取血，離心2000 r/min，取血清，采用酶聯免疫試劑盒，按試劑盒說明書要求進行檢測光密度，根據標準曲線計算結果。

1.5 統計學方法

所獲數據采用SPSS 11.0 版本軟件進行分析。計量資料實驗數據以(±s)表示，并進行單因素方差分析。方差齊性檢驗采用Levene 法。各樣本間比較應用SNK 檢驗，實驗組與對照組比較用Dunnett-t 檢驗，各組兩兩比較用LSD 檢驗。

2 結果

2.1 對血清cAMP、cGMP 的含量及比值的影響

銀屑病豚鼠模型血清cAMP 含量均顯著降低，cGMP 含量均顯著升高(P＜0.01)。與模型組比較，白疕合劑各劑量組和消銀顆粒組cAMP 含量均顯著升高(P＜0.01)，cGMP 含量均降低(P＜0.01)，cAMP/cGMP 比值均升高(P＜0.01);消銀顆粒組與白疕合劑高劑量組cGMP 含量及cAMP 含量比較均有統計學意義(P＜0.05)。消銀顆粒組與白疕合劑各劑量組cAMP/cGMP 比值比較無統計學意義(P＞0.05)。提示白疕合劑能夠增高銀屑病豚鼠模型血清中cAMP 的含量，降低銀屑病模型豚鼠血清中cGMP 的含量，白疕合劑高劑量效果優于消銀顆粒。白疕合劑能夠升高銀屑病模型豚鼠血清中cAMP/cGMP比值，且隨濃度的增高作用增強，對cAMP/cGMP比值的調節，白疕合劑與消銀顆粒無差別，見表1、圖1。

表1 對血清cAMP、cGMP 的含量及比值的影響(±s，n=8)

表1 對血清cAMP、cGMP 的含量及比值的影響(±s，n=8)

注:與空白對照組比較，aP＜0.01;與模型組比較，bP＜0.01;與消銀顆粒組比較，cP＜0.05;與消銀顆粒組比較，dP＞0.05

組別 cAMP(pmol/ml)cGMP(pmol/ml)cAMP/cGMP空白對照組 25.79±1.96b 1.91±0.09b 13.54±1.49 b模型組 5.18±0.35a 4.15±0.12a 1.25±0.09a白疕高劑量組 10.00±0.46abc 3.14±0.10abc 3.18±0.12abd白疕中劑量組 9.57±0.63ab 3.26±0.15ab 2.94±0.25abd白疕低劑量組 8.83±0.34ab 3.66±0.13ab 2.42±0.08abd消銀顆粒組 9.11±0.26ab 3.27±0.14ab 2.79±0.16 ab

圖1 各組血清cAMP/cGMP 比值的比較

2.2 對血清VEGF 水平的影響

銀屑病豚鼠模型血清VEGF 顯著高于正常組，造模成功。經治療，中藥白疕合劑治療各劑量組與消銀顆粒組血清VEGF 均低于模型組(P＜0.01)，高劑量組與空白對照組無顯著性差異(P＞0.05)，低劑量組與消銀顆粒組無顯著性差異(P＞0.05)，但仍高于正常對照組(P＜0.05)，見表2。

表2 對血清VEGF 水平的影響(±s)

表2 對血清VEGF 水平的影響(±s)

注:與正常對照組比較，aP＜0.01;與模型組比較，bP＜0.01

組別 n VEGF(pg/ml)與消銀顆粒組比較空白對照組 8 68.21±3.71b＜0.01模型組 8 111.29±6.16a＜0.01白疕高劑量組 8 72.14±2.98b＜0.01白疕中劑量組 8 75.99±2.98ab＜0.05白疕低劑量組 8 82.31±4.60ab＞0.05消銀顆粒組 8 81.24±6.10 ab

3 討論

中藥白疕合劑為遼寧中醫藥大學附屬醫院積數十年治療銀屑病的臨床經驗而研制成的院內制劑，取得了確切滿意的療效，尤以進展期效果最為顯著。課題組對該中藥多角度進行了動物模型研究，以進一步明確該中藥治療銀屑病的作用機制。

現在研究認為，銀屑病表皮增生與cGMP/cAMP的比率增高有關［3］。環核苷酸cAMP 和cGMP 的調節對表皮細胞的生長和分化有重要意義。cAMP 通過激活磷酸化酶加速糖原代謝，從而抑制表皮有絲分裂，減慢轉換率，并抑制細胞周期的進程，從而達到抑制細胞增殖的作用。cGMP 在表皮細胞的增殖、分化中也起一定的作用。它能促進表皮的增殖。cGMP 可以調節cAMP 的濃度及其信號通路，和cAMP 是人體對立的兩種調節系統，在細胞增殖發動時，細胞內的cAMP 含量降低，cGMP含量增高。cAMP 抑制細胞生長繁殖，cGMP 則增強細胞繁殖。現在認為，銀屑病表皮的增生不是簡單的由于cAMP 減少和cGMP 增高，更重要的是cGMP/cAMP 的比率增高所致。

VEGF 又稱血管通透因子(vascular permeability factor，VPF)，屬于生長因子中的血小板衍生的生長因子家族之一。在眾多血管生成因子中，VEGF 是唯一能特異性作用于血管內皮細胞的因子，是目前已知最強的促血管生成因子［4］。VEGF 的主要作用是促進血管內皮細胞增生，提高血管的通透性。銀屑病的病理損害中經常有VEGF 及其受體表達的增高，這可能是銀屑病發病中一些炎癥反應及真皮乳頭血管增生的分子基礎［5］。銀屑病患者皮損VEGF 增多，抑制患者VEGF 的生成可以用來治療該病［6］。

本研究結果顯示，中藥白疕合劑可能通過提高血清中cAMP 含量、降低cGMP 含量、調節cAMP/cGMP 比值抑制銀屑病表皮細胞增殖。通過降低血清VEGF 水平，從作用于微血管角度調節銀屑病發病的部分炎癥和免疫過程，取得療效。下一步課題組會繼續深入探討該藥對銀屑病的其它免疫學機制的相關影響。

［1］鄭敏.銀屑病發病機制研究中若干問題的思考［J］.中華皮膚科雜志，2006，39(3):121-123.

［2］邵長庚.銀屑病防治研究及合理治療［M］.北京:中國協和醫科大學出版社，2006:84.

［3］王俠生，廖康煌.楊國亮皮膚病學［M］.上海:上?？茖W技術文獻出版社，2005:507.

［4］Dvorak AM，Feng D.The vesiculo-vaeuolar orsanelle(VVO).A new endothelial cell permeability organelle［J］.J Histoehem Cytoohem，200l，49(4):419-432.

［5］王剛，張開明.銀屑?。跰］.北京:人民衛生出版社，2005:71.

［6］Creamer D，Allen M，Jaggar R，et al.Mediation of systemic vascular hyperpermeability in severe psoriasis by circulating vascular en dothelial growth factor［J］.Arch Dermatol，2002，138 (6):791-796.