貝母屬植物的分類鑒定方法研究進展

梁孝祺 陳金金 俞超 盛夢俊

貝母屬Fritillaria 是百合科Liliaceae 中的一個大屬，主要分布于北半球的溫帶地區，常以干燥的鱗莖入藥，具有清熱潤肺、止咳化痰的功效。近年來，大量的貝母新種和變種被發現，保守估計已被發現的貝母屬物種超過80 種，變種超過50 種［1］，但在臨床處方上通常僅將川貝母與浙貝母兩大類進行區分，或是通過中醫所稱的6 個道地產區進行劃分:伊貝母、川貝母、平貝母、湖北貝母、浙貝母及皖貝母。貝母是典型的多基原藥材，如川貝母，在《中華人民共和國藥典》(一部)中將卷葉貝母、暗紫貝母、甘肅貝母、梭砂貝母統稱為川貝母，而后又加入瓦布貝母和太白貝母［2］。貝母的多基原性和龐大的物種基數，給其在流通、育種過程中的物種鑒定帶來了困難。本文就貝母屬藥用植物的分類鑒定方法進行了分析整理，就形態學、化學成分多樣性、分子標記等方面對貝母屬鑒定方法作一綜述，并比較不同方法的優缺點。

1 形態學鑒定

形態學鑒定是中藥材最基本的鑒定方法，通過對藥材植株的形態特征及其外觀的顯微特征存在的差異來鑒別不同的藥材。但是僅僅通過植株外形進行鑒別，難以判斷受到環境影響造成植物發育上的差異，且在近緣植物中往往缺乏足夠明顯的不同點。

隨著顯微技術的發展，通過花粉形態和淀粉顆粒形態鑒定貝母屬藥材成為主流，1996年羅毅波等［3］通過花被片、花藥、花粉表面紋飾等特性的分析，對中國橫斷山區及臨近地區及長江中下游地區的貝母屬植物進行了分類學修訂，對暗紫貝母Fritillaria unibracteata、天目貝母Fritillaria monantha、浙貝母Fritillaria thunbergii 中的部分物種進行了歸并。2002年何斜［4］則通過淀粉顆粒的直徑、臍點形狀、氣孔等特征成功對五大貝母類群進行了區分，明確區別了浙貝母、川貝母、平貝母和伊貝母四種常見藥用貝母。濮祖茂等［5］對植物葉表面掃描電鏡觀察，對云南貝母屬藥用植物川貝母Fritillaria cirrhosa、梭砂貝母Fritillaria delavayi 等進行了聚類分析，確定了不同貝母葉表面的特征具有差異性，也可作為聚類分析的依據。

2 化學成分多樣性鑒定

不同種類的藥材，其化學成分必然存在差異，而同種藥材，其主要成分的含量也存在差異。通過薄層色譜法、高效液相色譜法、熱分析法及紅外光譜法等，對不同貝母的化學成分差異進行分析，進而對其進行區分。

肖培根等［1］在貝母親緣學研究中列舉了從29類貝母屬植物中分離鑒定出的120 多個生物堿，并指出了不同貝母所含生物堿種類和含量的差異。如浙貝甲素、浙貝乙素及西貝素在不同貝母中存在典型性的差異，西貝素僅存在于高海拔西部地區如四川、甘肅、新疆等產地的川貝母、康定貝母、伊貝母等，而浙貝甲素、浙貝乙素僅存在于東南部低海拔地區產地的浙貝母、安徽貝母、湖北貝母等［6］。

2.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)是目前主流的貝母化學成分多樣性鑒定方法，其利用不同化合物在流動相中的移動速度不同這一特點，通過色譜柱對液相中的化合物進行分子水平的分離，并形成對應分離時間的不同化合物信號強度峰圖，以此比對不同貝母化學成分(主要是生物堿)種類及含量的差異。王聰等［7］在對川貝母的HPLC 指紋圖譜研究中發現了川貝母復合群的成分指紋具有共同特征，并直觀區別了川貝母復合群與浙貝母。但蔡曉翠等［8］通過HPLCELSD 指紋圖譜對10 批不同種植區的伊貝母進行的研究發現，10 批伊貝母色譜峰圖譜整體特征相似度高，但伊犁不同產區伊貝母中西貝母堿含量有明顯差異，即使是同一產區，不同時期采集的伊貝母西貝母堿含量也有差異。液相色譜法的缺點即是難以排除自然環境、栽培方法等對植株化學成分及含量的影響。針對這一影響特點，周建良等［9］運用快速液相色譜(rapid resolution liquid chromatography，RRLC)分析了不同產地浙貝母的主成分特征圖譜，強調了在高度精確的定量分析基礎上各藥材之間化學成分及含量上的差異，不僅能作為不同貝母品種的區分依據，還為區分同種藥材產地和采收季節及藥材的規格、品級提供了快速直觀的定量數據支持。

2.2 其它生化鑒定方法

為解決HPLC、薄層色譜法等分析技術操作繁瑣，分析周期長的問題，楊復森等［10］將便攜式近紅外光譜儀運用到了貝母屬中藥鑒定中，在對川貝母的種群識別、不同基原品種的定性分析和混偽品的鑒別中均取得了理想的效果，且大大降低了實驗流程消耗的時間和成本。陳效忠等［11］則運用操作簡單、價格低廉的電化學振蕩技術，通過電化學指紋圖譜反映藥材整體化學成分的差異，成功區分川貝母、平貝母和浙貝母等藥材，為中藥材的快速鑒定提供了新思路。

3 分子標記鑒定

從分子遺傳學角度來看，物種表現型的差異歸根結底應追溯到基因型的差異，即在DNA 序列上的差異，而且這種差異不受環境和個體差異的影響。因此，對基因組序列差異的比較研究無疑為植物分類和鑒定提供了本質依據。隨著生命科學技術不斷取得重大突破，分子生物學鑒定方法應運而生，應用分子標記技術鑒定中藥基原植物及飲片取得了快速發展。

3.1 隨機擴增多態性DNA 標記技術

隨機擴增多態性DNA 標記(random amplified polymorphic DNA，RAPD)技術興起于1990年，是基于RFLP 技術的第二代分子標記技術，具有操作簡單，成本低廉的優勢。其運用隨機合成的短序列引物(8-12bp)以基因組DNA 為模板進行擴增，由于其DNA 上發生堿基的插入、缺失而使隨機引物無法結合，從而使產生的DNA 圖譜呈現多態性。該技術的特點是不需要基因探針，即使是完全未知的序列，也能擴增出多態性片段。

2009年，陸含等［12］運用RAPD 技術對浙貝母4個品種及5 種貝母屬藥材進行了分析。根據多態性片段分析結果，將4 個浙貝母品種聚類在一起，而5種貝母屬藥材中，浙貝母的變種—東貝母與浙貝母最為接近，伊貝母與浙貝母關系最遠，其結果與傳統分類學相符。龔伯奇［13］則通過RAPD 技術對青海省四個地區的暗紫貝母遺傳多樣性進行分析，獲得的多態性信息準確地將每個樣地的樣品聚類在一起，并強調了RAPD 技術在種下等級的鑒定效力。在鑒定的穩定性方面，周潔［14］運用RAPD 標記和ISSR 標記對12 個浙貝母品種進行了分子鑒定，區分了磐安本地種植的貝母和引種貝母類群，并發現RAPD 的聚類結果與ISSR 標記得到的聚類結果基本一致，肯定了RAPD 技術的鑒定準確性。

3.2 簡單重復區間標記技術

簡單重復區間標記技術(inter-simple sequence repeat，ISSR)是對SSR 技術進行改進后的新型分子標記技術，又稱為微衛星—錨定PCR 技術。DNA 在復制及修復過程中DNA 的滑動和錯配，或者減數分裂期間姐妹染色單體的不均等交換均會產生簡單重復區間(simple sequence repeat，SSR)，這些區間的兩端多為保守的單拷貝序列，且SSR 在整個基因組中分布較為均勻，在不同品種間變異廣泛。ISSR 技術以SSR 序列為引物并在3’端或者5’端加上2～4個隨機核苷酸，PCR 過程中使錨定引物引起特意位點的退火，使重復序列間DNA 片段成功擴增。由于不同物種和品種的SSR 在基因組中的位置和數量均有差異，故擴增結果將表現出多態性［15］。劉曉賢等［16］運用ISSR-PCR 技術，對8 個浙貝母居群、1 個東貝母居群、1 個皖貝母居群和2 個川貝母居群進行聚類分析，發現磐安地區的浙貝居群已明顯區別于其他產區浙貝居群，并且長期的留種栽培使磐安浙貝遺傳多樣性水平降低，形成相對穩定的遺傳。王果平等［17］同樣通過ISSR 技術，對新疆貝母屬遺傳多樣性進行了聚類分析，將十種貝母分為三個類群。結果顯示，大白花貝母、小白花貝母、黃花貝母和托里貝母聚類在了一起，這與羅毅波等［3］提出觀點相吻合，對于戈壁貝母的分類也和前人的研究結果一致。

雖然ISSR 兼具了RAPD 的簡便性和SSR 的穩定性，但對于反應體系的要求較為嚴格，趙鑫等［18］研究了TagDNA 聚合酶用量、dNTP、引物和Mg2+濃度四種因素對伊貝母ISSR-PCR 擴增的影響，確定了適于伊貝母ISSR 的反應體系，這對其他貝母屬藥用植物的ISSR 反應體系建立有指導作用。

3.3 DNA 條形碼技術

DNA 條形碼技術(DNA barcode)通過選取普遍性高且在種內遺傳較為穩定但種間進化速率較快的DNA 序列，設計相應的引物，通過PCR 技術擴增出待鑒定物種的對應DNA 片段序列，通過直接測序的方法獲得序列信息，運用MEGA 等軟件比對序列信息，便能對其進行物種鑒定和系統發育構件，具有操作簡單，鑒定效率高，重復性強，不受樣品個體差異和環境影響等優點［19］。陳士林等［20］在對2373份藥材樣品的研究基礎上，提出了以核基因ITS2 序列為核心葉綠體基因psbA-trnH 序列為輔的中藥材DNA 條形碼分子鑒定指導原則，ITS2 序列是作為貝母屬藥用植物條形碼鑒定的理想序列。在對貝母屬的近緣屬——重樓屬的研究中，朱英杰等［21］對psbA-trnH、rpoB、rpoC1、rbcL、matK 和核ITS2 序列的PCR 擴增成功率和鑒定效率進行了對比，發現ITS2序列鑒定效果最好，在29 個物種67 份樣品中的鑒定效率為100%，可將中國大部分重樓屬物種準確區分開來，且在種內幾乎不存在差異。

基于ITS2 序列在百合科部分屬中的成功應用，羅焜等［22］同樣運用ITS2 序列對川貝母及其混偽品進行了鑒定。其結果表明，ITS2 序列能準確區分川貝母基原植物與其混偽品，并將六種不同的川貝母基原植物:卷葉貝母、暗紫貝母、甘肅貝母、梭沙貝母、太白貝母、瓦布貝母聚類在一起，驗證了藥典的正確性。另外，系統發育樹顯示，川貝母、甘肅貝母、梭沙貝母的多個樣品呈多物種交錯狀，推測其川貝母復合群可能是處于激烈分化的物種形成階段，一些種下等級在不同地區，植物形態和花部特征出現差異，而被劃分為不同物種，此推論與肖培根等［1］的討論相符。

3.4 其它分子標記技術

表達序列標簽(expressed sequence tags，ESTs)技術，是利用逆轉錄酶，對編碼蛋白質的mRNA 進行逆轉錄，構建物種cDNA 文庫，并對文庫中的克隆進行大規模測序，通過ESTs 圖譜區分基因水平的差異。目前，在川貝母的cDNA 文庫中，已有超過2158 條高品質的ESTs 序列信息，和超過1343 個獨特的轉錄組［23］。現已發現包括HMGR、CYP450s、FPSs 和氨基酸轉移酶在內的數十個川貝母生化活性相關的轉錄集合，這為進一步研究貝母甾體生物堿合成相關的轉錄組基因鑒定技術提供了技術支持。ESTs 序列還有望用于探究同源基因在保守物種之間進化水平的差異，是潛在的系統發育標記［24］。

擴增片段長度多態性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)技術是建立在RFLP 技術基礎上的一種新型分子標記技術，利用EcoRI、PstI 及SacI 等限制性內切酶切割基因組DNA，形成酶切位點不同、分子量大小不等的隨機性酶切片段，在其兩端接上雙鏈人工接頭后，進行PCR 擴增，電泳后獲得具有多態性的指紋圖譜。徐金中等［25］運用AFLP分析了浙江主產區浙貝母的種質遺傳多樣性，發現AFLP 技術在不同產地浙貝母中具有豐富的遺傳多樣性，其聚類關系也與產地有明顯的關聯性。在地理位置上較近的東陽、磐安、永康、縉云產地的貝母遺傳距離同樣較近，而浙貝母最初的產地象山浙貝母居群與其他居群相對獨立，這進一步表明象山浙貝母居群遺傳基因較為保守，與其他遷徙居群形成明顯差異。

4 總結及展望

綜合大量研究結果，對各種方法進行了總結分析，其不同鑒定方法的優缺點如表1所示。

在對不同方法的比較中，肖培根、羅焜等均認為，從基因角度入手，深入到遺傳物質遺傳分化的研究對貝母屬以及其它藥用植物的鑒定具有準確、穩定、可重復的優勢。而DNA 條形碼技術，是現階段內非常適合作為藥用植物大批量快速鑒定的技術，其條形碼序列ITS2 片段，存在于細胞核中，適用于貝母鱗莖干片、粉末等市場流通樣品的鑒定，鑒定效果理想［22，31］。系統化、標準化的DNA 條形碼鑒定技術能夠貫穿中藥材種植、加工、生產、流通等各個環節，實現對中藥材基原物種、粉末、組織等材料來源的快速鑒定［20］，在生物物種監管、藥材市場管理、生物多樣性及系統進化研究等方面有著巨大的潛在作用，能很好地解決貝母市場魚龍混雜，各個相似品種間以次充好的現象。

綜上所述，對于貝母屬植物以及其它中藥材的鑒定，無論是生化標記還是分子標記，都走向一個數據收集、數據庫構建的過程，在新技術方面，期望隨著生物技術的發展，ESTs 技術、系統生物學、SNP技術和基因芯片技術能為貝母屬藥用植物研究提供有力幫助［32］。

表1 在貝母屬中不同鑒定方法的優劣分析

［1］肖培根，姜艷，李萍.中藥貝母的基原植物和藥用親緣學的研究［J］.植物分類學報，2007，45(4):473-487.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)［M］.2010年版.北京:中國醫藥科技出版社，2010.

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