消渴康對糠尿病腎病大鼠腎臟基質金屬蛋白酶9與蛋白酶組織抑制劑1表達的影響

李夢 李鳳婷 耿建國

糖尿病腎病是糖尿病主要的微血管并發癥，也是導致糖尿病患者致殘致死的主要原因之一，而細胞外基質(extracellu-lar matrix，ECM)進行性積聚是糖尿病腎病發展過程中最基本的病理損傷［1］。生理狀態下，ECM 產生和降解處于機體精確調控下，起到支持、連接組織結構等生理作用。但糖尿病腎病時，糖代謝紊亂及其所引發的血流動力學改變、細胞因子釋放、信號通路開放、組織酶調節等多種因素綜合作用使ECM 動態平衡被打破，生成增加而降解減少，導致ECM 進行性積聚，進而引發并加劇糖尿病腎病［2-5］。本課題組之前的實驗已證實消渴康能夠有效抑制糖尿病腎病時腎組織轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、P38絲裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinasse，P38MAPK)表達從而明顯降低ECM 的產生［6-8］，而自擬消渴康是否也對ECM 降解產生影響尚不清楚。MMP-9 和TIMP-1 是影響ECM 降解的重要組織酶之一，在糖尿病腎病形成和發展過程中，MMP-9 降低與TIMP-1 升高可導致ECM 異常積聚。本實驗通過觀察消渴康對糖尿病腎病大鼠腎組織MMP-9 與TIMP-1 表達，從另一方面探討其對糖尿病腎病大鼠腎功能的保護作用，現將研究報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物

SD 雄性大鼠48 只，體重160～180 g，鼠齡2～3月齡，購自首都醫科大學實驗動物科學部。

1.2 藥物和試劑

消渴康(生黃芪30 g、葛根30 g、決明子10 g、薏苡仁30 g、丹參10 g)湯劑，根據耿建國教授臨床經驗自擬，藥材購自北京祥威藥業公司;氯沙坦甲片，商品名科素亞，購自杭州默沙東制藥有限公司生產，批準文號為“國藥準字H20000371”，規格50 mg/片;鏈尿佐菌素(streptozotocin，STZ)，購自美國Sigma 公司;免疫組化試劑盒，購自美國abcam 公司。

1.3 儀器

LEICA 數字顯微照相機，NIS-Elements Basic Research 圖像采集分析系統。

1.4 造模

10%水合氯醛(0.35 ml/100 mg)腹腔麻醉后切除右側腎臟。術后2 周，腹腔注射STZ(50 mg/kg)。72 小時后，尾靜脈采血，當血糖濃度≥16.7 mmol/L，尿糖定性＞+ + +，確定糖尿病腎病造模成功。

1.5 分組及給藥

將造模成功動物隨機分為正常組、模型組、氯沙坦組(5.2 mg/kg·d)、消渴康小劑量組(6.3 g/kg·d)、消渴康中劑量組(12.6 g/kg·d，)，消渴康大劑量組(25.2 g/kg·d)，每組8 只。連續灌胃12 周，每天1次，正常組、模型組每日灌服等量蒸餾水。

1.6 取材

藥物干預后第4、8、12 周末，眼眶下靜脈叢取血2 ml。離心取血清，用全自動生化儀測定腎功能。藥物干預第12 周末，處死大鼠，取出腎臟，去被膜，Bouin 液固定，常規制片。

1.7 觀察指標

免疫組化法檢測MMP-9 和TIMP-1 表達情況，每組采集10 個40 倍隨機視野，作積分光密度統計。

1.8 統計學處理

對于各組數據采用單因素方差分析，并作組間兩兩比較，P＜0.05 為差異有統計學意義，統計分析軟件使用SPSS 13.0。

2 結果

2.1 MMP-9、TIMP-1 在腎組織表達情況

MMP-9 顯色為棕黃色染色顆粒，主要分布在腎小管上皮細胞中，在腎小球上有散在分布。與正常組比較，模型組MMP-9 顯色明顯減弱，而消渴康小劑量組顯色則明顯加強，見圖1;TIMP-1 顯色為棕黃色染色顆粒，主要分布在腎小管上皮細胞中，在腎小球上有散在分布。與正常組比較，模型組、氯沙坦組、消渴康大劑量組顯色均明顯加強，消渴康中劑量組、消渴康小劑量組未見明顯加強。與模型組比較，消渴康中劑量組、消渴康小劑量組顯色明顯減弱，見圖2。

2.2 MMP-9、TIMP-1 積分光密度比較

各組數據采用單因素方差分析，并作組間兩兩比較。MMP-9 結果比較:與正常組比較，模型組、氯沙坦組、消渴康大劑量組、消渴康中劑量組均顯著性降低;與模型組比較，氯沙坦組極顯著性降低(P＜0.05);與氯沙坦組比較，消渴康三劑量組均極顯著性增高(P＜0.01)。TIMP-1 結果比較:與正常組比較，模型組、氯沙坦組、消渴康大劑量組均顯著性增高(P＜0.05);與模型組比較，消渴康中劑量組、消渴康小劑量組均極顯著性降低(P＜0.01);與氯沙坦組比較，消渴康小劑量組極顯著性降低(P＜0.01)。MMP-9/TIMP-1 結果比較:與正常組比較，模型組、氯沙坦組、消渴康大劑量組均極顯著性降低(P＜0.01);與模型組比較，消渴康中劑量組、消渴康小劑量組均顯著性升高(P＜0.05);與氯沙坦組比較，消渴康中劑量組、消渴康小劑量組均顯著性升高(P＜0.05)，具體見表1。

3 討論

腎臟ECM 合成與降解通常處于動態平衡之中。糖尿病腎病時，高糖作用下ECM 合成與降解的動態失衡是導致腎臟ECM 進行性積聚的主要原因［9］。Ⅳ型膠原是ECM 的主要成分，而MMP-9 是Ⅳ型膠原的主要降解酶之一，TIMP-1 是MMP-9 特異性的抑制劑。MMP-9 與TIMP-1 的共同作用對Ⅳ型膠原的降解起到重要調節作用。糖尿病腎病時，正是由于MMP-9 表達減少與TIMP-1 表達增加，導致MMP-9/TIMP-1 下降，從而使得Ⅳ型膠原降解減少，ECM成分穩定增高，ECM 合成與降解間動態平衡被打破，最終使糖尿病腎病逐漸向深層次發展［10-12］。

圖1 腎組織MMP-9 免疫組化染色(40 ×10)

圖2 腎組織TIMP-1 免疫組化染色(40 ×10)

表1 各組大鼠腎組織MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1 積分光密度比較(±s)

表1 各組大鼠腎組織MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1 積分光密度比較(±s)

注:與正常組比較，aP＜0.05，bP＜0.01;與模型組比較，cP＜0.05，dP＜0.01;與氯沙坦組比較，eP＜0.05，fP＜0.01。

組別 n MMP-9 TIMP-1 MMP-9/TIMP-1正常組10 6.21±1.63 1.10±0.34 6.03±2.23模型組 10 4.38±0.73b 3.21±2.15b 1.93±1.24b氯沙坦組 10 2.54±0.65bd 2.23±1.34a 1.41±0.65b消渴康大劑量組 10 4.40±1.12bf 2.17±0.81a 2.27±0.9b消渴康中劑量組 10 4.80±1.04af 1.52±0.92d 4.27±2.3ce消渴康小劑量組 10 6.98±1.93df 0.70±0.35df 11.60±4.97 bdf

本實驗針對糖尿病腎病正虛邪實、虛實互見的病機特點，采用消渴康對糖尿病腎病大鼠進行藥物干預。其中，葛根與生黃芪同用，益氣養陰、生津止渴、扶助正氣，正氣恢復則抗邪有力，有利于驅除邪氣;生薏苡仁、決明子與丹參同用，利濕祛濁、活血祛瘀、攻逐邪氣，邪氣蠲除則消除邪氣對正氣的危害，有利于正氣的恢復。諸藥合用，扶正祛邪，具有益氣養陰、利濕化濁、活血化瘀的作用，與糖尿病腎病病機十分符合。

本課題組先前的實驗研究已證實消渴康能夠有效抑制糖尿病腎病時腎組織TGF-β1、P38MAPK表達，從而抑制ECM 的生成，有效的保護了腎臟微觀結構，改善腎功能異常。而本實驗結果又證實消渴康能夠顯著提高糖尿病腎病大鼠腎組織MMP-9表達(消渴康小劑量組，P＜0.01)，降低TIMP-1 表達(消渴康小劑量組、消渴康中劑量組，P＜0.01)，有效加強ECM 降解，從而抑制ECM 在腎臟積聚。由此可見，消渴康對于糖尿病腎病的保護作用很可能是通過有效抑制腎臟ECM 異常積聚、維護腎臟微觀結構而實現的，而消渴康對ECM 異常積聚的抑制作用不僅表現在降低ECM 合成，同樣表現在增強ECM 降解上，從而具有較好的抑制ECM 積聚作用，最終起到保護糖尿病腎病腎臟功能、延緩糖尿病腎病發展的作用，為后期臨床研究提供了一定的參考依據。

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