金港欖香烯與欖香烯脂質體注射液的指紋圖譜研究*

謝 恬，李鋮璐，徐淑媛，王 宇，楊友劍，趙 宏，劉興元，于麗紅，張滌菲，曾昭武

（1.杭州創新中藥標準化研究所有限公司，杭州 310053；2.大連華立金港藥業有限公司，大連 116000；3.杭州師范大學，杭州 310012）

·中藥研究·

金港欖香烯與欖香烯脂質體注射液的指紋圖譜研究*

謝 恬1，2，3，李鋮璐3，徐淑媛1，王 宇2，楊友劍2，趙 宏2，劉興元2，于麗紅2，張滌菲2，曾昭武3

（1.杭州創新中藥標準化研究所有限公司，杭州 310053；2.大連華立金港藥業有限公司，大連 116000；3.杭州師范大學，杭州 310012）

[目的]通過檢測金港欖香烯與欖香烯脂質體注射液的指紋圖譜，考察它們的質量穩定性。[方法]分別對10批金港欖香烯與欖香烯脂質體注射液，采用氣相色譜法檢測其指紋圖譜，采用中藥指紋圖譜相似度計算軟件計算相似度。[結果]采用氣相色譜法檢測它們的指紋圖譜穩定可靠，發現欖香烯和欖香烯脂質體注射液都有6個共有特征峰，各批次欖香烯和欖香烯脂質體注射液的相似度都不低于0.995。[結論]建立的金港欖香烯和欖香烯脂質體注射液指紋圖譜符合要求，為不同批次產品的質量穩定性提供了保證。

欖香烯；脂質體；注射液；氣相色譜；指紋圖譜

欖香烯（C15H24）是一類單環結構的倍半萜烯類化合物，是從郁金等傳統中藥中發現的抗腫瘤活性成分[1]，其中β-欖香烯是主要活性成分。欖香烯對多種腫瘤具有確切療效，無明顯毒副作用[2]。金港欖香烯脂質體注射液采用循證醫學系統評價證實欖香烯脂質體注射液安全有效，且可延長生存期、改善生活質量、抗腫瘤轉移復發[3-7]。為了保證欖香烯和欖香烯脂質體注射液的質量并對產品質量實施有效的監控，對金港欖香烯和欖香烯脂質體注射液的指紋圖譜進行研究，具有非常重要的實際意義和應用價值。

1 實驗材料

1.1 儀器 Agilent6890N氣相色譜儀，HP-5（30mm×0.32 mm，0.25 μm）彈性石英毛細管柱，FID檢測器（美國Agilent公司），DF－101S集熱式恒溫加熱攪拌器（河南省予華儀器有限公司）。

1.2 試藥與試劑 將采自瑞安境內不同地域（下林、岱西、八甲、綠嶼、登陽、涂頭、東川、四甲、馬嶼、焦炕村）的溫莪術藥材提取的莪術油10批進行精餾，獲得原料藥欖香烯10批。將該10批欖香烯小試制備欖香烯脂質體注射液。藥材采集地、欖香烯和欖香烯脂質體注射液編號一一對應。β-欖香烯對照品（純度97%）、空白制劑與欖香烯脂質體注射液（由大連華立金港藥業有限公司提供）。甲醇、乙酸乙酯為色譜純，無水硫酸鈉、丙酮等為分析純。

2 實驗方法與結果

2.1 色譜條件 色譜條件根據指紋圖譜技術要求，參考文獻[8-17]，研究發現，欖香烯、欖香烯注射液的指紋圖譜應與溫莪術、莪術油指紋圖譜具有相關性，由于需要比較這幾種物質的相關性，因此4種物質的指紋圖譜色譜條件最好盡量一致，經反復的篩選，確定儀器條件如下：HP-5色譜柱（30 mm×0.32 mm，0.25 μm），檢測器溫度250℃，進樣口溫度150℃，載氣為氮氣，氮氣流速：1.0 mL/min，氫氣：40 mL/min，空氣：400 mL/min，分流比為20∶1，柱溫采取程序升溫，起始溫度125℃，保持8 min，以5℃/min的速率升溫至90℃，保持14 min，再以10℃/min的速率升溫至115℃，然后以1℃/min的速率升溫至130℃，保持25 min，以2℃/min的速率升溫至140℃，保持30 min，以10℃/min的速率升溫至260℃，進樣量1 μL，理論板數按β-欖香烯峰計算不得低于10000。

2.2 對照品溶液的制備 將β-欖香烯對照品用甲醇溶解，稀釋后進樣分析。欖香烯、欖香烯脂質體注射液中主要有效成分是β-欖香烯，且是欖香烯、欖香烯脂質體注射液共有，積分面積在指紋圖譜中比例較大而穩定，因此采用β-欖香烯作為參照物。

2.3供試品溶液制備 1）取10批欖香烯作為供試品，分別取100 μL用乙酸乙酯稀釋至1 mL，即得欖香烯供試品溶液。定量吸取1 μL后進樣分析。2）取各批次欖香烯脂質體注射液2 ml，置10 ml刻度試管中，加無水硫酸鈉0.8 g，振搖使溶解，置60℃水浴破乳5 min，取出，放冷至室溫，加丙酮至10 mL，強力振搖使完全溶解，靜置，取上清液作為欖香烯脂質體注射液供試品溶液。

2.4 空白脂質體注射液溶液和空白溶劑實驗 取空白脂質體注射液2 mL，同“供試品溶液制備”項下操作，進樣。取空白溶劑丙酮，進樣。結果表明，空白注射液在25～47 min間無色譜峰出現，空白注射液在該色譜條件下對供試品指紋圖譜無干擾，見圖1。丙酮溶劑在25～47 min間無色譜峰，說明丙酮溶劑在該色譜條件下對供試品指紋圖譜無干擾，見圖2。

圖1 空白脂質體溶液氣相色譜圖譜Fig.1 Gas chromatogram of blank liposome solution

圖2 空白溶劑-丙酮氣相色譜圖譜Fig.2 Gas chromatogram of acetone as blank solvent

2.5 穩定性實驗 1）取欖香烯適量，制備供試品溶液，分別于0、2、3、4、5、11 h重復進樣5次，記錄各共有特征峰保留時間和積分峰面積。以β-欖香烯為參照峰（S），換算出各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果發現共有特征峰的相對保留時間的相對標準偏差（RSD）分別為0.008%，0.006%，0.000%，0.008%，0.007%，0.007%，相對峰面積的RSD分別為 0.722%，0.878%，0.000%，0.228%，0.427%，0.116%，均小于3%，說明整個檢測系統穩定性良好，樣品在11 h內穩定，符合要求。2）取欖香烯脂質體注射液供試品溶液，分別于0、1、2、3、4、9、10、11、12 h進樣分析。結果表明各共有特征峰的相對保留時間的RSD分別為0.0178%，0.0141%，0.0000%，0.0118%，0.0137%，0.0117%，相對峰面積的RSD分別為0.6952%，0.3412%，0.0000%，0.1782%，0.6593%，0.3548%，RSD均小于3%，說明供試品在12 h內穩定，符合要求。

2.6 精密度實驗 取金港欖香烯、欖香烯脂質體注射液，制備供試品溶液，分別連續進樣5次，分析。結果表明，欖香烯或欖香烯脂質體注射液共有峰的相對保留時間和相對峰面積基本一致，欖香烯相對保留時間的RSD分別為0.003%，0.003%，0.000%，0.003%，0.003%，0.002%，相對峰面積的RSD分別為0.739%，0.847%，0.000%，0.251%，0.476%，0.116%。欖香烯脂質體注射液相對保留時間的RSD分別為0.018%，0.013%，0.000%，0.012%，0.014%，0.013%，相對峰面積的RSD分別為0.887%，0.344%，0.000%，0.142%，0.886%，0.267%。RSD均小于3%，精密度良好，符合要求。

2.7 重現性實驗 取同一批金港欖香烯和欖香烯脂質體注射液各5份，制備供試品溶液后檢測，結果發現金港欖香烯和欖香烯脂質體注射液中各共有峰的相對保留時間及相對峰面積基本一致，欖香烯相對保留時間的RSD分別為0.022%，0.019%，0.000%，0.016%，0.022%，0.021%，相對峰面積的RSD分別為0.840%，0.644%，0.000%，0.221%，0.342%，0.216%；欖香烯脂質體注射液相對保留時間的RSD分別為0.046%，0.042%，0.000%，0.039%，0.046%，0.042%，相對峰面積的RSD分別為0.946%，1.396%，0.000%，1.241%，0.838%，0.788%。RSD均小于3%，重現性良好，符合要求。

2.8 指紋圖譜選擇及特征峰的標定 根據金港欖香烯10批供試品氣相色譜圖，選擇代表樣品（3）作為對照指紋圖譜。并以10批供試品氣相色譜圖譜所給出的相關參數，在該色譜條件下得出所有成分的色譜峰，且在47 min內全部出完。比較各批供試品色譜圖發現6個色譜峰是各批共有，從而確定它們為共有特征峰。指紋圖譜顯示共有特征峰應有6個。相對保留時間（峰序號）依次為：0.9061（1），0.9851（2），1（S），1.0439（3），1.0623（4），1.0709（5）。相對峰面積（峰序號）依次為0.0297±0.0131（1），0.0392± 0.0049（2），1.0000（S），0.1153±0.0214（3），0.0155± 0.0109（4），0.0530±0.0320（5）。詳見圖3。10批供試品，以β-欖香烯峰為參照峰，計算各指紋峰的相對峰面積、相對保留時間，結果表明原料藥中β-欖香烯峰面積占80%以上，而其他幾個峰均小于10%，因此峰面積比值不作要求，但相對保留時間比較固定，其RSD小于3%，符合要求。

圖3 金港欖香烯（3）氣相色譜指紋圖譜Fig.3 Gas chromatographic fingerprint of Kingkong elemene(3)

同上，根據金港欖香烯脂質體注射液10批供試品氣相色譜圖，選擇代表樣品（1）作為對照指紋圖譜。比較各批供試品的色譜圖發現6個色譜峰是各批樣品共有，從而確定它們為共有特征峰，見圖4。6個共有特征峰的相對保留時間（峰序號）依次為：0.9063（1），0.9853（2），1.0000（S），1.0440（3），1.0625（4），1.0710（5）；相對峰面積（峰序號）依次為：0.0300±0.0134（1），0.0395±0.0049（2），1.0000（S），0.1141±0.0208（3），0.0154±0.0108（4），0.0493± 0.0301（5）。結果表明，注射液主成分中β-欖香烯峰面積占80%以上，而其他幾個峰均小于10%，因此峰面積比值不作要求，但相對保留時間比較固定，其RSD小于3%，符合要求。

圖4 金港欖香烯脂質體注射液（1）氣相色譜指紋圖譜Fig.4 Gas chromatographic fingerprint of Kingkong elemene liposomal injection(1)

2.9 指紋圖譜相似度及圖譜 以共有模式為參照，采用中藥指紋圖譜相似度計算軟件計算，得到各批次金港欖香烯指紋圖譜的相似度和圖譜，見表1、圖5。結果表明各批次金港欖香烯指紋圖譜的相似度均大于0.997。同上，計算得到各批次金港欖香烯脂質體注射液指紋圖譜相似度和圖譜，見表2、圖6，結果表明各批次金港欖香烯脂質體注射液指紋圖譜的相似度均大于0.997。

3 討論

表1 10批金港欖香烯指紋圖譜相似度計算結果Tab.1 The results of fingerprint similarity of 10 batches of Kingkong elemene

目前，對欖香烯脂質體注射液中欖香烯的含量測定主要是氣相色譜法[18-19]。氣相色譜法特別適用于含揮發性成分藥材和制劑的指紋圖譜研究，具有簡單易行、可比性強、靈敏度高、分析速度快、分離度好等優點[20]。根據前期實驗研究結果，確定了欖香烯脂質體注射液、欖香烯的最優檢測條件、分析方法，采用氣相色譜法檢測，樣品的穩定性、精密度和重現性良好。對金港欖香烯、欖香烯脂質體注射液進行氣相色譜分析，結果如圖3、4，發現金港欖香烯脂質體注射液各特征峰均可在原料藥金港欖香烯指紋圖譜中得到追蹤，說明具有相關性，證明了金港欖香烯脂質體注射液藥物的質量穩定可靠。經大連華立金港藥業有限公司質量控制部門跟蹤回顧性試驗得欖香烯原料藥、欖香烯脂質體注射液相似度均在0.996以上。本研究按照《中藥注射劑色譜指紋圖譜試驗研究操作規程指南(試行)》的規定，采用相似度計算軟件進行計算，得到能全面、準確地反映欖香烯脂質體注射液、原料藥質量情況的指紋圖譜，比采用單一成分的含量作為質量控制指標更全面。對欖香烯脂質體注射液、原料藥進行質量控制，建立指紋圖譜保證產品質量的穩定，為保證不同批次產品的質量控制提供了科學依據，為中藥注射制劑規范化生產、走向國際市場奠定了基礎。

圖6 10批金港欖香烯脂質體注射液氣相色譜指紋圖譜Fig.6 The gas chromatographic fingerprints of 10 batches of Kingkong elemene liposomal injection

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Study on fingerprint of Kingkong Elemene and Elemene liposomal injection

XIE Tian1,2,3,LI Cheng-lu3,XU Shu-yuan1,WANG Yu2,YANG You-jian2,ZHAO Hong2,LIU Xing-yuan2,YU Li-hong2,ZHANG Di-fei2, ZENG Zhao-wu3
（1.Hangzhou Innovation TCM Standardization Research Institute Co.,Ltd.,Hangzhou 310053,China;2.Dalian Holley Kingkong Pharmaceutical Co.,Ltd.,Dalian 116000,China;3.Hangzhou Normal University,Hangzhou 310012,China）

[Objective]To detect the fingerprint of Kingkong Elemene and Elemene liposomal injection for observing their quality stability.[Methods]The fingerprints of 10 batches of Kingkong Elemene and Elemene liposomal injection were detected by gas chromatography(GC),and their similarity was calculated by the fingerprint similarity calculation software of traditional Chinese medicine(TCM).[Results]The GC method for detecting their fingerprint was stable and reliable.Six common characteristic peaks were all found in Kingkong Elemene and Elemene liposomal injection.The fingerprint similarity of these batches of Kingkong Elemene or Elemene liposomal injection was not lower than 0.995.[Conclusion]The resulted fingerprint of Kingkong Elemene and Elemene liposomal injection meet the requirements,and provide a guarantee for the quality stability of different batches of the product.

Elemene;liposome;injection;gas chromatography;fingerprin

R284

：A

：1672-1519（2014）05-0301-05

2013-12-08）

（本文編輯：高 杉，張震之）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.05.17

國家十二五重大新藥創制科技重大專項資助項目（2011ZX09201-101-05）。

謝 恬（1961-），男，博士，教授，博士生導師，從事中藥新制劑、新技術、制藥工程、新藥研發、GMP管理等工作。