UPLC/Q-TOF-MS和PLS-DA在鴉片生物堿檢測及分類判別中的應用

劉翠梅，花鎮東，白燕平

（1.中國人民公安大學 刑事科學技術系，北京 100038；2.公安部禁毒情報技術中心國家毒品實驗室，北京 100193）

鴉片（opium），又叫阿片，俗稱大煙，源于罌粟植物蒴果，其所含主要生物堿嗎啡是生產毒品海洛因的原材料。鴉片中除嗎啡外還含有可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可汀4種常量生物堿和多種痕量生物堿如：牛心果堿、勞丹素、那碎因等。這些常量和痕量生物堿是推斷鴉片產地和海洛因的植物源產地（生產海洛因所用鴉片的產地）的重要判別指標[1-2]。

傳統的鴉片中生物堿的檢測方法主要有氣相色譜法（GC）[3]、液相色譜法（HPLC）[4]、毛細 管電泳法（CE）[5]等。由于受檢測方法的限制，以往鴉片樣品分析主要關注常量生物堿，而較少關注痕量生物堿。近年來液質聯用分析技術已廣泛用于毒品及生物樣品的分離分析[6-7]，新發展起來的超高效液相/四極桿飛行時間串聯質譜儀聯用技術（UPLC/Q-TOF-MS），集UPLC快速有效的色譜分離能力和Q-TOF高分辨質譜靈敏度高、定性能力強的優勢于一體[8]，必將成為毒品樣品特征分析最有效的分析手段之一。

本文首次建立了一種同時檢測鴉片樣品中17種常量和痕量生物堿UPLC/Q-TOF-MS方法，根據精確分子量、二級碎片離子、色譜保留時間分析來實現各生物堿的定性鑒定，并結合多變量模式識別方法中的偏最小二乘法（PLS-DA）找到不同地域鴉片樣品中生物堿的差異，建立了判別國產鴉片和緬甸產鴉片的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

5600Triple TOF高分辨四極桿與飛行時間質譜儀（美國 AB Sciex）；Analyst TF 1.6 和 Multiquant數據處理系統（美國AB Sciex）；30A超高效液相色譜分析系統（日本島津）。

乙腈（色譜純）；甲酸銨（HPLC 級，純度＞99%）。

鹽酸嗎啡、鹽酸乙酰可待因、罌粟堿、磷酸可待因、那可?。ü膊课镒C鑒定中心）；波爾定堿（FLUKA，純度＞98%）；麗春花定堿（Chromadex，RG）；血根堿、原阿片堿（上海同田生物技術股份有限公司，純度98%）；牛心果堿（凱利得生物醫藥技術（上海）有限公司）純度 97%，DL-勞丹素（ChromaDex，RG）；氫可它寧（ChromaDex，RG）；DL-去甲基勞丹素（Aldrich）；金黃紫堇堿（Toronto Research Chemicals Inc）；可待民堿，那碎因，罌粟啶三種對照品為國家毒品實驗室合成制得。

1.2 方法

1.2.1 樣品選取

本文選取了緬甸產鴉片200份，國內產鴉片樣品78份。國產鴉片包括甘肅鴉片19份，河北17份，內蒙23份，四川10份，貴州9份。

1.2.2 溶液配制

準確稱取各標準品配成1 mg/mL單標儲備液，在5℃保存。移取適量的標準儲備液，用初始比例流動相配成100μg/L的工作液。

1.2.3 樣品處理

鴉片樣品于55℃真空干燥，干燥后用瑪瑙研缽研磨均勻。稱取150mg的鴉片樣品，加入15mL的甲醇，浸泡過夜，超聲30min，用初始比例的流動相將樣品稀釋100倍，過0.2μm濾膜，進UPLC/Q-TOF-MS分析。

1.3 條件

1.3.1 色譜條件

液相條件：色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18RRHD（2.1mm×100mm，1.8μm）；進樣體積：1μL；柱溫：40℃；流動相 A：10 mM 甲酸銨（pH=5.1），流動相 B：乙腈；流速：0.4 mL/min；梯度洗脫程序：0～1.0 min， 85%B；1.0～6.0 min，85%～68%B；6.0～9.0 min，68%～30%B；9.0～10.0 min，30%～5%B；10.0～11.0 min，5%B；11.0～12.0min，5%B～85%B；12.5～15.0min，85%B。

1.3.2 質譜條件

電噴霧離子源（ESI），正離子全掃描及二級質譜掃描。 離子噴霧電壓：5.5kV；去簇電壓（DP）：80 V；噴霧溫度：600 ℃；霧化氣（N2，GS1）流速：50 psi；脫溶劑氣（N2，GS2）流速：50 psi，氣簾氣（CUR）流速：30 psi；質量軸：100～1000amu；一級質譜碰撞能量（CE）：10V；二級質譜碰撞能量（CE）：40V±15V。

1.3.3 數據處理

各生物堿色譜峰處理采用peakview和multiquant軟件（美國AB Sciex），通過導入離子峰并適當調整積分參數的方式完成色譜峰的識別與峰匹配，得到各個化合物的峰面積值。

不同產地鴉片樣品的分類和變量的比較選用SIMCA-P軟件的偏最小二乘判別分析法（PLS-DA）進行分析。

2 結果和討論

2.1 UPLC分離條件的優化

實驗初期，分別采用對甲醇、乙腈、甲酸體系、甲酸銨體系、乙酸銨體系、甲酸-甲酸銨體系、乙酸乙酸銨體系進行比較，最終發現純甲酸銨和乙酸銨體系條件下各生物堿的分離條件最好，最終選取10 mM甲酸銨（pH=5.1）體系作為最終的緩沖體系。圖1是某鴉片樣品的UPLC-Q-TOF總離子流圖。

圖1 鴉片樣品的UPLC/Q-TOF-MS總離子流圖

2.2 化合物的定性

UPLC/Q-TOF-MS質譜可以提供化合物的保留時間、MS/MS碎片離子、精確質量數等信息，這些信息可為化合物的準確定性提供充分的依據。鴉片中生物堿的信息見表1。通過保留時間、準確分子量和二級譜圖實現對各生物堿的定性。各生物堿的質量數偏差均在2ppm以內。

表1 生物堿的質譜分析參數

2.3 不同產地鴉片分類結果

本文選取了國內產的鴉片樣品78份和緬甸產鴉片200份。常量生物堿的平均色譜峰面積百分比均值約為10%～20%之間，痕量生物堿中牛心果堿、勞旦寧、勞丹素的平均面積百分比約為1%～3%之間，其他痕量生物堿的平均峰面積百分比約為0.05%～1%。結果見表2。

表2 不同產地鴉片樣品生物堿平均峰面積百分比

通過AB 5600的Multiquant軟件導出各生物堿的峰面積數據，采用SIMCA-P軟件對生物堿峰面積的數據進行PLS-DA分析，其中X矩陣為各生物堿的峰面積數據；Y矩陣為各樣品的類別，將國內產鴉片的類別定義為1，緬甸產鴉片的類別定義為2。X矩陣數據在計算前先進行歸一化處理，歸一化方法為每個化合物的峰面積值減去其峰面積均值，除以其標準方差。

PLS-DA通過交叉驗證的方式自動擬合得到三個主成分（t1，t2，t3），三個主成分的 R2X 值（所解釋 X矩陣信息的比例）、R2Y值（所解釋Y矩陣信息的比例）和 Q2值（模型的預測能力）依次為：t1（R2X=16.3%，R2Y=57.3%，Q2=54.1%），t2（R2X=25%，R2Y=5.3%，Q2=8.9%），t3（R2X=8.6%，R2Y=3.7%，Q2=3.7%）。 三個主成分（t1，t2，t3）累積值（R2X=49.9%，R2Y=66.3%，Q2=59.7%）。Q2值是PLS-DA模型最重要的參數，Q2值越大表明模型的預測能力越強。結果表明該模型的預測能力較好。

依據PLS-DA模型的相關性系數值可以得到預測模型為 y=0.042×Morphine-0.17×Oripavine+0.24×Codeine+0.13×Hydrocotarnine+0.13×Reticuline+1.26×Codamine-0.1×Laudanidine+0.052×Narceine-0.14×Boldine-0.27×Thebaine+0.27×Cryptopine-0.19×Norlaudanosine-0.055×Papaveraldine-0.11×Laudanosine+0.079×Papaverine+0.050×Protopine+0.044×Noscapine（注：公式中各生物堿的值為其峰面積歸一化后得到的值）。模型的判別閾值為0，當y＞0時為國內產鴉片，當y＜0時為緬甸產鴉片。該模型判別的正確率為96%，準確度高。

從由t1和t2組成的“PLS-DA分類圖”（見圖2）可以看出國內產鴉片與緬甸產鴉片有明顯差異，國內產鴉片主要分布在右上側，緬甸產鴉片主要分布在左下側。

圖2 鴉片樣品PLS-DA分類圖

從“PLS-DA因子載荷圖”（見圖3）同時結合“不同產地鴉片樣品生物堿平均峰面積百分比”（見表2）可以看出，可待民堿、可待因、嗎啡、牛心果堿、罌粟堿在國產鴉片中的含量相對較高，而蒂巴因、東罌粟堿、波爾定堿、去甲基勞丹素在緬甸產鴉片中的含量相對較高。其中可待民堿、牛心果堿、東罌粟堿、波爾定堿、去甲基勞丹素這6種痕量生物堿含量在兩地區鴉片樣品中有顯著性差異，由此可見痕量生物堿是區分鴉片產地的重要變量。

圖3 鴉片樣品生物堿載荷圖

3 結論

綜上所述，本文首次建立了UPLC/Q-TOF-MS法測定鴉片中17種常量和痕量生物堿的方法，通過保留時間、精確質量數和二級碎片離子對各化合物定性分析，并采用PLS-DA法實現了國產鴉片和緬甸產鴉片的產地判別。結果表明：國產鴉片中可待因、可待民堿、嗎啡、牛心果堿、罌粟堿的含量相對較高，而緬甸產鴉片中蒂巴因、東罌粟堿、波爾定堿、去甲基勞丹素的含量相對較高。

該方法簡便、快速、靈敏，是一種有效的區分國產鴉片和緬甸產鴉片的手段，同時該研究也為進一步建立國產海洛因和緬甸產海洛因的植物源產地判別方法提供了科學依據。

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