化肝通絡方對膽汁性肝硬化模型大鼠的抗纖維化作用及其機制研究

宣佶 田耀洲 曹鵬 胡春萍 蔡雪婷 張偉

（1.南京中醫藥大學，江蘇南京 210023；2.解放軍81醫院，江蘇南京 210002；3.江蘇省中醫藥研究院，江蘇南京 210028）

化肝通絡方對膽汁性肝硬化模型大鼠的抗纖維化作用及其機制研究

宣佶1，2田耀洲1，3曹鵬3胡春萍3蔡雪婷3張偉3

（1.南京中醫藥大學，江蘇南京 210023；2.解放軍81醫院，江蘇南京 210002；3.江蘇省中醫藥研究院，江蘇南京 210028）

目的：探討化肝通絡方對膽汁性肝硬化模型大鼠的抗纖維化作用及其機制。方法：大鼠隨機分為假手術組、模型組、熊去氧膽酸（UDCA）組和化肝通絡方高、中、低劑量組，除假手術組外，其余各組大鼠均利用結扎大鼠膽總管方法制造膽汁淤積肝硬化模型。于造模后第2周開始分別給藥，給藥4周后取大鼠血清測總膽紅素（T-Bil）、直接膽紅素（D-Bil）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）等肝功能指標，取部分肝臟行HE染色觀察肝臟病理形態變化，ELISA法測定血清α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、金屬蛋白酶組織抑制因子-1抗體（TIMP-1）、細胞間黏附分子（ICAM-1）的表達，免疫組化方法測定肝組織轉化生長因子β1（TGF-β1）、信號傳導蛋白3（Smad3）、Smad7的表達。結果：與假手術組相比，模型組大鼠T-Bil、D-Bil、ALT、AST等肝功能指標均明顯升高，且血清中α-SMA、TIMP-1、ICAM-1高表達。模型組大鼠肝臟出現炎性細胞活動及纖維組織增生等病理改變。化肝通絡方各劑量組、UDCA組與模型組比較，各項肝纖維化指標均有明顯下降，肝組織中TGF-β1、Smad3蛋白表達亦明顯下降，Smad7表達明顯升高。結論：化肝通絡方對膽汁性肝硬化模型大鼠具有明顯的抗纖維化作用，其機制可能與TGF-β/smad信號通路有關。

膽汁性肝硬化 化肝通絡方 肝功能 肝纖維化指標 病理學 實驗研究

膽汁性肝硬化分為繼發性膽汁性肝硬化和原發性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC），前者由肝外膽管長期梗阻引起。PBC是一種慢性進展性自身免疫病，因肝內長期、持續性的膽汁淤積，引起肝臟纖維化、肝硬化并最終導致肝衰竭，其起病隱匿，早期常常無明顯癥狀，部分患者到已達肝功能失代償期時才就診，因而預后較差[1-2]。藥物治療方面熊去氧膽酸（UDCA）是目前公認的對PBC具有確實療效的首選治療藥物，但迄今尚無特異性藥物，而UDCA也僅僅對部分患者有效[3]。田耀洲教授通過中醫辨證論治研究總結了中藥化肝通絡方，治療本病獲得了較好的療效。本研究擬對化肝通絡方的療效進行科學評價，并探索其作用機制。

1 實驗材料

1.1 藥品與試劑熊去氧膽酸（UDCA），Losan Pharma GmbH生產；化肝通絡方（藥物組成：人工牛黃0.1g、紅花15g、五靈脂15g、余甘子30g、印度獐牙菜15g、肉豆蔻10g、黃芪25g、木香10g、傘梗虎耳草15g、芫荽果10g、沉香3g、石榴子20g、烈香杜鵑8g、冬葵果15g、甘草10g），由江蘇省中西醫結合醫院提供；血清α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）ELISA測定試劑盒，BioSource公司（Lot No20120709）；金屬蛋白酶組織抑制因子-1抗體（TIMP-1）ELISA測定試劑盒，R&D Systems China（Lot No291100）；細胞間黏附分子（ICAM-1） ELISA測定試劑盒，R&D Systems China（Lot No295330）；抗TGF-β1、Smad3、Smad7多克隆抗體，Cell Signaling Technology。

1.2 實驗動物清潔級SD大鼠72只，全雄，體重（180±20）g，購于南京青龍山動物繁殖場，合格證號：SCXK（蘇）2010-0001。

1.3 主要儀器全自動生化分析儀：日本日立公司；光學顯微鏡：日本Olympus公司；自動放射免疫計數機：中國科學技術大學中佳公司；臺式高速冷凍離心機：Eppendorf centrifuge 5417R，德國Eppendorf公司；電熱恒溫水槽：DK-8D型，上海醫用恒溫設備廠；酶聯免疫檢測儀：Thermo公司。

2 實驗方法

2.1 分組與造模取72只大鼠標號后，隨機分為假手術組12只與造模組60只。大鼠予10%水合氯醛溶液（300mg/kg）腹腔注射麻醉后，沿腹正中線開腹，找到并暴露膽總管，假手術組僅分離膽總管后關腹，造模組在肝門部膽管周圍的近端結扎膽總管后，常規關腹。術后連續3d注射青霉素40萬單位/只，正常喂養[4]。

將造模成功的60只膽汁性肝硬化模型大鼠隨機分為模型組、熊去氧膽酸（UDCA，58.3mg·kg-1·d-1）組和化肝通絡方高劑量（4.36g·kg-1·d-1）、中劑量（2.18g·kg-1·d-1）、低劑量（1.09g·kg-1·d-1）組，每組12只，并于第8天開始各組大鼠按10mL/kg的體積灌胃相應藥物，1次/d，共7d。假手術組及模型組給等體積生理鹽水。于最后1次灌胃后24h處死各組大鼠測定相關指標。

2.2 檢測指標

2.2.1 肝功能按照南京建成生物工程研究所試劑盒的方法檢測總膽紅素（T-Bil）、直接膽紅素（D-Bil）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、γ-谷氨酰轉肽酶（GGT）及堿性磷酸酶（ALP）。

2.2.2 肝組織學觀察肝組織經4%中性甲醛固定，石蠟切片，按常規方法行HE染色，光鏡下觀察肝組織的病理變化。

2.2.3 血清α-SMA、TIMP-1、ICAM-1測定將檢測血清嚴格按照酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒操作步驟進行，分別測定血清中α-SMA、TIMP-1、ICAM-1的含量。

2.2.4 肝組織轉化生長因子β1 （TGF-β1）、信號傳導蛋白3（Smad3）、Smad7的表達檢測免疫組化染色采用SP法，處死后的大鼠肝臟經10%的甲醛溶液固定，石蠟包埋，4μm連續切片，脫蠟至水，枸櫞酸緩沖液高壓修復抗原3.5min，待切片晾至室溫后滴加3%H2O2，37℃孵育15min，PBS洗3次，每次5min，滴加胰酶消化15min，PBS洗片3次，每次5min。分別滴加TGF-β1、Smad3、Smad7一抗工作液（工作液濃度分別為1∶100、1∶50，用PBS稀釋），4℃孵育過夜。次日取出切片，PBS洗片3次，每次5min；滴加二抗工作液，37℃孵育40min。蒸餾水洗2次，每次5min，用現配制的DAB溶液顯色10min，蘇木精襯染2min，分化、返藍各30s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，計算機掃描分析蛋白的陽性數目、灰度值和相對光密度。

3 實驗結果

3.1 治療后各組大鼠血清肝功能指標測定見表1。

3.2 各組大鼠肝臟組織HE染色病理形態假手術組大鼠肝小葉結構存在，肝板排列整齊，個別結構稍紊亂，以中央靜脈為中心向周圍放射狀排列，肝細胞多邊形，漿豐富，核大而圓，少見雙核；模型組大鼠肝臟散在炎性細胞浸潤，纖維結締組織增生將肝小葉分割成假小葉結構；UDCA組大鼠肝臟無明顯炎性細胞浸潤，纖維結締組織增生明顯改善；化肝通絡方低劑量組大鼠肝臟炎性細胞浸潤存在，纖維結締組織輕度增生；化肝通絡方中劑量組大鼠肝臟炎性細胞浸潤減少，少許纖維結締組織增生；化肝通絡方高劑量組大鼠肝臟無明顯炎性細胞浸潤，纖維結締組織增生明顯改善。見圖1。

3.3 各組大鼠血清α-SMA、TIMP-1、ICAM-1表達比較見表2。

3.4 各組大鼠肝組織TGF-β1、Smad3、Smad7表達比較見表3。

表1 各組大鼠治療后肝功能生化指標（±s）

表1 各組大鼠治療后肝功能生化指標（±s）

注：與模型組比較，**P＜0.01；與假手術組比較，##P＜0.01；與UDCA組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別動物數（只）ALT（U/L）AST（U/L）假手術組8 T-Bil（μmol/L）30.8±11.559.4±11.4 D-Bil（μmol/L）GGT（U/L）0.84±0.29 ALP（U/L）0.25±0.4258.38±1.8747.67±16.42 567.0±238.8##611.6±283.4##模型組854.06±9.70##40.38±4.90##254.43±23.37##318.38±198.90##UDCA組842.6±26.6**128.2±73.4**0.88±0.27**0.68±0.37**58.08±1.91**53.70±19.60**化肝通絡方高劑量組845.2±31.0**109.9±48.1**0.97±0.39**0.85±0.35**△59.04±3.14**55.90±26.13**化肝通絡方中劑量組834.6±18.3**△99.0±36.7**△1.07±0.28**△0.84±0.19**△57.66±3.71**49.78±23.19**化肝通絡方低劑量組8228±125.9**△△209.0±73.2**△1.56±0.62**△1.26±0.49**△58.20±1.84**114.56±95.29**△

圖1 各組大鼠肝組織病理變化（HE，200×）

表2 各組大鼠治療后血清α-SMA、TIMP-1、ICAM-1水平比較（±s）pg/mL

表2 各組大鼠治療后血清α-SMA、TIMP-1、ICAM-1水平比較（±s）pg/mL

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與假手術組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與UDCA組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別動物數假手術組α-SMATIMP-1 8 ICAM-1 507.01±17.99390.73±22.89186.84±7.89模型組81325.16±158.44##994.02±128.43#576.01±108.44##UDCA組8587.43±36.55**468.87±23.42*254.45±36.54**化肝通絡方高劑量組8650.35±52.04*△412.37±32.60**△268.36±52.04**化肝通絡方中劑量組8728.36±110.11*△549.99±44.47*△307.89±54.67*△化肝通絡方低劑量組81011.79±100.95*△△583.55±57.01*△407.51±100.95*△

表3 各組大鼠肝組織TGF-β1、Smad3、Smad7免疫組化染色的比較（±s）

表3 各組大鼠肝組織TGF-β1、Smad3、Smad7免疫組化染色的比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與假手術組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與UDCA組比較，△P＜0.05。

Smad3組別假手術組（n=5）灰度值相對光密度267.43±17.750.1745±0.0543 1795±357##1356±457##538±152##TGF-β1陽性數目陽性數目464±223502±274灰度值相對光密度163.89±9.870.1574±0.0184灰度值相對光密度177.78±18.650.1145±0.0234 Smad7陽性數目1787±254模型組（n=5）205.04±11.70#0.1734±0.0856#223.76±9.70#0.1534±0.0156#194.91±18.04#0.1200±0.0193#UDCA組（n=5）765±356*164.4±8.48*0.1344±0.0258*667±156*194.45±12.450.1344±0.0178*1556±467*223.56±8.700.1354±0.0146化肝通絡方高劑量組（n=5）832±236*187.6±10.44*△0.1234±0.0343*702±236*195.67±8.54*0.1234±0.0193*1695±357**235.04±11.70*0.1334±0.0856化肝通絡方中劑量組（n=5）1256±328*△189.87±9.45△0.1434±0.0146*△862±176**△232±8.45△0.1434±0.0156862±186*△217.91±8.45*△0.1234±0.0147化肝通絡方低劑量組（n=5）1395±223*△193.45±12.87△0.1540±0.0936*△896±423**△196.45±13.87*0.1210±0.1936*△896±417*△197.17±12.87△0.1278±0.0156

4 討論

近年來，中醫藥辨證施治治療膽汁性肝硬化取得了一定療效。現代醫家多依據病程的不同階段將本病分別歸屬于“皮膚瘙癢”、“黃疸”、“脅痛”、“鼓脹”、“積聚”、“水腫”、“血證”、“虛勞”等范疇[5]。本病虛實夾雜，本虛標實。本虛以肝、脾、腎三臟為主，標實以氣滯、濕濁（熱）、血瘀、水停等為主。腎主骨，肝主筋，肝腎精血不足，失于濡養，則患者多骨節疼痛、腰膝酸軟、發枯齒搖、經水早閉、目澀口干。脾主運化，運化水谷精微及水濕，脾虛則納少便溏，濕濁內阻，濕聚水停，腹脹足腫，久之則乏力倦怠，萎黃神疲。肝主疏泄，與膽腑互為表里，煩勞則肝失條達，氣滯血瘀、濕熱熏蒸則致黃疸[5-6]。化肝通絡方由紅花、五靈脂、牛黃、印度獐牙菜、黃芪、木香等組成，其中紅花、五靈脂等活血通絡，牛黃、印度獐牙菜等清熱解毒、疏肝利膽，黃芪、木香等健脾理氣。全方具有清熱解毒、活血利水、理氣健脾、補益肝腎等功效。

肝纖維化是膽汁性肝硬化的重要中間環節，目前研究表明，肝纖維化的顯著特征是細胞外基質（Extra cellular matrix，ECM）的增加和成分的改變，而肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）的活化和增殖是其關鍵和中心環節[7]。α-SMA是肝星狀細胞活化的特征性標志物[8]；TIMP-1與肝纖維化密切相關，TIMPs可選擇性地結合MMPs，抑制MMPs降解ECM的活性[9]；ICAM-1的表達是HSC活化的固有的生物學特性之一，ICAM-1為免疫球蛋白超家族的一種黏附分子，能表達于淋巴細胞及中性粒細胞等表面，在炎癥反應中，ICAM-1是細胞與細胞接觸過程中起中心作用的一種細胞黏附分子[10]。

TGF-β/smad細胞信號通路與肝纖維化的發生、發展密切相關，TGF-β1參與活化肝星狀細胞并促進膠原蛋白基因表達，肝臟纖維化使TGF-β1合成明顯增多，肝臟組織表達TGF-β1增強，而Smads蛋白家族作為TGF-β1膜受體的特異性底物，根據功能分為三類：膜受體激活Smad、通用Smad和抑制性的Smad。Smad3屬于激活的Smad，在肝纖維化發生時其表達顯著增加，具有活化、促進膠原合成等效應。與之相反，肝纖維化的進展常常伴隨有抑制性激活的Smad7表達水平低下，因而不能有效地抑制激活的Smad磷酸化，并阻止TGF-β1的刺激信號向下游傳導，導致TGF-β1信號通路持續激活，最終發生肝纖維化、肝硬化甚至肝細胞癌[11]。

本實驗采用經典方法復制膽汁性肝硬化模型。與假手術組比較，模型組大鼠血清中AST、ALT、ALP、T-Bil，D-Bil，GGT均顯著升高，α-SMA、TIMP-1、ICAM-1蛋白的表達也明顯升高，結合肝臟組織病理學改變，證實動物模型復制成功。本研究發現，化肝通絡方各劑量組能明顯降低膽汁性肝硬化模型大鼠血清中異常升高的肝功能指標和α-SMA、TIMP-1、ICAM-1蛋白的表達。與模型組比較，化肝通絡方給藥濃度與療效呈正相關，其中以高劑量組最為顯著，存在濃度依耐性，表現出明顯的量效關系。與UDCA組比較，化肝通絡方高劑量組血清指標差異無統計學意義，而中、低劑量組差異顯著，說明化肝通絡方高劑量組與陽性藥UDCA療效相近。同時病理組織學檢查結果顯示，化肝通絡方高、中劑量組對模型大鼠肝纖維組織增生、肝組織炎性細胞活動有顯著的改善作用，進一步證實化肝通絡方具有明顯的抗纖維化作用。肝組織免疫組化結果提示，模型組較假手術組TGF-β1、Smad3蛋白的陽性數目和灰度值、相對光密度表達增高，抑制性激活蛋白Smad7表達明顯降低，化肝通絡方及UDCA均可顯著抑制模型大鼠TGF-β1、Smad3蛋白的表達，上調抑制性激活蛋白Smad7表達，說明化肝通絡方具有治療膽汁性肝硬化的作用，其作用機制可能與TGF-β/smad信號通路相關。

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R575.205文獻識別碼A

1672-397X（2014）03-0073-03

宣佶（1982-），男，碩士研究生，主治醫師，消化內科專業。

田耀洲，tianyaozhou1960@163.com

2013-12-31

編輯：吳寧

國家自然科學基金（81060255）；“江蘇省六大人才”高峰項目（2013-WS-048）；江蘇省科技廳技術基礎設施建設計劃項目（BM2008152）