滋腎通關古方對慢性腎盂腎炎大鼠尿SIgA和T淋巴細胞亞群表達的影響

蔣春波倪道磊金偉民梁國強張露蓉孫偉

（1.蘇州市中醫醫院，江蘇 蘇州 215009；2.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023；3.江蘇省中醫院，江蘇 南京 210029）

滋腎通關古方對慢性腎盂腎炎大鼠尿SIgA和T淋巴細胞亞群表達的影響

蔣春波1，2倪道磊1金偉民1梁國強1張露蓉1孫偉3

（1.蘇州市中醫醫院，江蘇 蘇州 215009；2.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023；3.江蘇省中醫院，江蘇 南京 210029）

目的：觀察滋腎通關古方對慢性腎盂腎炎大鼠的預防和治療作用，從免疫學角度研究慢性腎盂腎炎可能的發病機制。方法：大鼠隨機分為正常組、模型組、中藥治療1組（造模后立即開始灌胃中藥）、中藥治療2組（造模后30天開始灌胃中藥）、西藥組（術后30天開始灌胃左氧氟沙星），除正常組外建立慢性腎盂腎炎大鼠模型，分別給藥后，觀察各組大鼠尿常規和尿培養陽性情況，比較尿分泌型免疫球蛋白A（SIgA）、血T淋巴細胞亞群的表達。結果：西藥組、中藥治療1組、中藥治療2組大鼠尿常規和尿培養陽性率明顯低于模型組；中藥治療1組大鼠尿SIgA明顯高于模型組和西藥組；中藥治療1組大鼠CD3+細胞數、CD4+/CD8+比值明顯高于西藥組、中藥治療2組。結論：早期運用滋腎通關方治療慢性腎盂腎炎模型大鼠，能夠上調其體內CD3+T淋巴細胞數、CD4+/CD8+比值，促進其尿SIgA的分泌。

滋腎通關方 慢性腎盂腎炎 尿SIgA 血T淋巴細胞亞群 實驗研究

慢性腎盂腎炎（classical periarteritis nodusa，CPN）是臨床上一種常見病，常反復發作經久不愈，防治難度較大且預后不良。以往對其治療只是在使用抗生素方面下功夫，目的是殺死或抑制病原菌，控制感染。但對免疫功能低下者，單純使用廣譜抗生素不能有效控制感染，長期反復使用還會導致霉菌感染和耐藥菌株的產生以及菌群失調[1]，給臨床治療帶來了很多困難。故深入研究系統免疫和黏膜免疫，開展免疫調節治療將可能成為一條新途徑[2]。慢性腎盂腎炎多屬中醫學“淋證”范疇，病因多為“腎虛膀胱熱”，滋腎通關丸作為經典成方，在淋證治療中應用已久，且療效確切。本實驗擬通過建立理想的慢性腎盂腎炎動物模型，選擇尿分泌型免疫球蛋白A（SIgA）和血T細胞亞群作為觀測指標，從黏膜免疫和系統免疫角度來研究慢性腎盂腎炎的免疫損傷機制，并在此基礎上研究滋腎通關方的療效，以期更好地挖掘與開發古方經方。

1 實驗材料

1.1 實驗動物4～6周齡清潔級SD雄性大鼠，40只，體重（200±20）g，由蘇州大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：XCYK（蘇）2002-2008；實驗動物使用許可證號：SYXK（蘇）2002-0037。

1.2 菌種致病性大腸桿菌株（E.coli O111B4），蘇州市疾控中心惠贈，利用傾斜平板法制備1×108/mL濃度菌液待用，使用前測集落形成單位（CFU）值核實濃度。

1.3 藥品中藥飲片知母（批號121004）、黃柏（批號120913）、肉桂（批號120824），委托蘇州市中醫醫院中醫藥研究所購買于蘇州春暉堂飲片廠，并由蘇州市中醫院沈多榮副主任藥師鑒定。知母、黃柏、肉桂按10∶10∶1在蘇州市中醫院藥劑科煎煮并濃縮成滋腎通關藥液，每毫升含生藥1.76g。左旋氧氟沙星（左克）膠囊，揚子江藥業集團產品，批號：12061427，委托蘇州市中醫醫院藥劑科購買。

1.4 主要試劑與儀器戊巴比妥鈉：Sigma公司生產，批號091022；注射用青霉素G鈉：山東魯抗醫藥股份有限公司；大鼠分泌型免疫球蛋白A（SIgA）試劑盒，基爾頓生物科技（上海）有限公司，批號：201301；Rat CD3 FITC（批號：E0053290）、Rat CD4 APC（批號：11217150）、Rat CD8 PE（批號：11087001），均為LiankeDio公司生產；其他試劑均為市售分析醇。

酶標儀，芬蘭（352型，Labsystems Multiskan MS）；洗板機，芬蘭（AC8型，Thermo Labsystems）；微量高速離心機，國產（TG16W）；隔水式恒溫培養箱，國產（GNP-9080型）；流式細胞儀設備，型號：FACS Calibur；流式細胞儀計算機程序系統軟件：Multi TEST。

2 實驗方法

2.1 造模與分組按文獻[3]方法建立CPN大鼠模型。造模成功的標志以結扎側腎臟出現以下改變：大體標本上粗糙皮質瘢痕及相關腎乳頭收縮和腎盞的擴張，鏡下慢性腎間質性腎炎改變和腎盂/腎盞炎癥、纖維化。

取SD大鼠40只，按體重隨機分為5組，每組8只，分別設為正常組、模型組、西藥治療組、中藥治療1組、中藥治療2組。

正常組：同齡同種在相同條件下飼養的正常鼠。模型組：造模術后30d開始灌胃給生理鹽水每日1次，每次1mL。西藥組：造模術后30d，用左氧氟沙星0.1g/kg體重計算藥量（相當于成人標準劑量10倍），并將藥品配成所需濃度的懸濁液，灌胃每日1次，每次1mL，連續30d。中藥治療1組：術后即用中藥滋腎通關方水煎劑灌胃（相當于成人標準劑量7倍），每毫升含生藥1.76g，每日1次，每次1m L，連續給藥60d。中藥治療2組：術后30d，用中藥滋腎通關方水煎劑灌胃（相當于成人標準劑量7倍），每日1次，每次1mL，連續給藥30d。各組均于造模成功60d后無菌操作下抽取膀胱尿液，腹主動脈采血，檢測相關指標。

2.2 觀察指標和方法

2.2.1 尿常規和尿培養無菌操作下直接抽取膀胱尿液0.5mL，接種于平板培養基上，置于37℃溫箱中培養24h后，觀察細菌生長情況。尿培養結果記錄：細菌計數＞100000記為陽性，細菌計數＜5000記為陰性。尿常規結果記錄：白細胞＞“+”或有膿球者均記為陽性，少許或無白細胞記為陰性。

2.2.2 尿SIgA的檢測將收集的尿液，5000g離心15min，4℃，進行預處理，應用酶聯免疫（ELISA）法檢尿SIgA，用試劑盒中的標準稀釋液5倍稀釋尿液以避免尿液中的干擾物質影響檢測，按照說明書指定方法檢測。

2.2.3 T淋巴細胞亞群的檢測應用流式細胞儀，采用單克隆抗體SPA花環法測定外周血T淋巴細胞亞群（CD3+、CD4+、CD8+）。

2.3 統計學方法實驗數據使用SPSS15.0軟件進行統計處理。實驗結果為正態分布，滿足方差齊性，以（±s）表示，t檢驗采用配對t檢驗和2組獨立樣本t檢驗，多組間差異顯著性檢驗用單因素方差分析，組間比較用SNK（q）檢驗，各治療組與正常組比較用Dunnett-t檢驗。

3 實驗結果

3.1 各組大鼠尿常規和尿培養的檢測結果如表1所示，模型組大鼠尿常規和尿培養陽性數顯著高于正常組（P＜0.01），說明本實驗造模成功。西藥組、中藥治療1組、中藥治療2組大鼠陽性率明顯低于模型組（P＜0.01，P＜0.05）。西藥組、中藥治療1組、中藥治療2組組間兩兩比較，無顯著性差異。

表1 各組大鼠尿常規和尿培養檢測結果只

3.2 各組大鼠尿SIgA檢測結果見表2。

表2 各組大鼠尿液分泌型免疫球蛋白A（SIgA）的檢測結果（±s）

表2 各組大鼠尿液分泌型免疫球蛋白A（SIgA）的檢測結果（±s）

注：與模型組比較，**P＜0.01，***P＜0.001；與西藥組比較，△△P＜0.01。

組別動物數（只）尿SIgA（μg/mL）正常組81.51±0.09***模型組8 2.08±0.12西藥組8 2.14±0.06中藥治療1組8 2.91±0.30**△△中藥治療2組8 2.19±0.11

3.3 各組大鼠血液T淋巴細胞亞群表達情況結果見表3。與正常組比較，模型組大鼠CD3+、CD4+細胞數明顯降低，CD8+細胞數明顯升高，CD4+/CD8+比值明顯下降。與模型組比較，西藥組、中藥治療1組、中藥治療2組大鼠CD4+細胞數明顯升高，CD8+細胞數明顯下降，CD4+/CD8+比值明顯升高。中藥治療1組與西藥組、中藥治療2組比較，CD3+細胞數、CD4+/CD8+比值明顯升高。

表3 各組大鼠血T淋巴細胞亞群（CD3+、CD4+、CD8+）表達情況（±s）

表3 各組大鼠血T淋巴細胞亞群（CD3+、CD4+、CD8+）表達情況（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與西藥組比較，△P＜0.05；與中藥治療2組比較，#P＜0.05。

4 討論

慢性腎盂腎炎為臨床常見腎臟感染性疾病，是由細菌感染引起的慢性腎盂和腎實質炎癥[4]。過往的研究主要針對抗生素的選擇與使用，目前的研究熱點在其免疫機制，特別是黏膜免疫。黏膜免疫系統是全身免疫系統的一個重要組成部分，由黏膜局部的黏膜相關淋巴組織及免疫細胞共同組成，主要針對經黏膜表面進入的微生物產生應答，抵抗微生物對機體的侵襲[5]。與所有黏膜免疫系統相同，泌尿生殖道黏膜的黏膜上皮內及黏膜下含有大量免疫細胞。尿SIgA是尿路黏膜免疫系統的主要效應分子，它可以抵抗病原菌在泌尿道黏附[6]，從而使病原菌不能大量在泌尿道繁殖。研究顯示，尿SIgA含量低于正常水平時發生尿路感染的機會增加[7]。尿SIgA水平可以作為泌尿系統感染免疫反應的表現，也是可能還需要繼續治療的標志。實驗結果表明，模型組大鼠尿SIgA水平較對照組升高，提示可能與細菌進入尿路黏膜后，刺激黏膜免疫系統分泌SIgA相關，這是黏膜免疫應答的表現。中藥治療1組大鼠尿SIgA較其他各組顯著升高，提示滋腎通關方早期預防治療慢性腎盂腎炎能更大程度上調節黏膜免疫。

外周血中成熟的T淋巴細胞主要分為CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞兩個亞群，這兩個亞群相互協調，相互平衡。CD4+/CD8+比值維持在一個正常的范圍才能保證免疫功能的正常發揮，一旦失去平衡就會引起機體免疫功能紊亂并導致一系列病理變化[8]。CD4+T淋巴細胞減少時，機體不能使B淋巴細胞致敏成漿細胞，進而會使機體的特異性抗體產生不足，不能及時充分地清除病原菌。CD8+T淋巴細胞具有直接殺傷被病原菌感染的靶細胞的功能，同時CD8+的Ts又能抑制機體免疫應答，使機體產生抗體減少或者是機體產生抗體不及時，這也不利于機體對病原菌的清除[9]。CD4+/CD8+比值降低說明機體CD4+T淋巴細胞減少，CD8+T淋巴細胞正常或升高，機體免疫功能紊亂使機體不能及時產生抗體清除病原菌。本實驗中，與其他各組相比，模型組大鼠CD3+T淋巴細胞數、CD4+T淋巴細胞數降低極為顯著，CD8+T淋巴細胞數偏高。這可能提示大鼠在被細菌侵襲后，體內CD4+T淋巴細胞沒有及時有效地釋放出細胞因子，CD8+T淋巴細胞的Ts能抑制機體免疫應答，從而不能進一步刺激B細胞成為漿細胞產生抗體，使機體的特異性抗體產生不足，不能及時充分地清除病原菌。與西藥組、中藥治療2組比較，中藥治療1組大鼠CD3+、CD4+T淋巴細胞數值高，CD4+/CD8+比值升高，這也很好地說明了應用滋腎通關方早期預防治療慢性腎盂腎炎在系統免疫方面療效更顯著。

滋腎通關丸出自《蘭室秘藏》。方中知母和黃柏名曰“坎離丸”，黃柏瀉下焦腎經之火為君，知母滋陰潤燥為佐，兩者相須為用，有補水瀉火、滋陰清熱之功；肉桂溫補腎陽、行氣利水，有助于膀胱氣化功能的恢復。三者共用可清下焦濕熱，助膀胱氣化。現代藥理研究發現，知母、黃柏具有抑菌作用；桂皮油對革蘭氏陽性及陰性菌及霉菌有抑制作用。慢性腎盂腎炎可歸屬于中醫學“淋證”范疇，淋證之病因多為“腎虛膀胱熱”，這也是滋腎通關丸的立法依據。本研究表明，滋腎通關方治療，特別是早期預防治療，能夠上調慢性腎盂腎炎模型大鼠體內CD3+、CD4+T淋巴細胞數，促進其尿SIgA的分泌。筆者推測這可能與滋腎通關方組方原則與“腎虛膀胱熱”的病機相符之故，也進一步論證了“腎虛膀胱熱”與黏膜免疫的理論相關性。

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R692.170.5

A

1672-397X（2014）04-0077-03

蔣春波（1983-），男，博士研究生，主治中醫師，研究方向：腎臟病的中西醫結合診治。jiangjunsz120@163. com

2012-11-01

編輯：吳寧

蘇州市“科教興衛”青年科技項目（KJXW2011027）