骨巨細胞瘤干細胞的分離鑒定

周振華，李 焱，黃 權，王旭東，徐樂勤，陳 素，肖建如

骨巨細胞瘤(giant cell tumor of bone，GCTB)是常見的原發骨腫瘤之一，好發于青壯年。盡管該腫瘤轉移少見，但是其具有侵襲性和潛在惡性，局部刮除術后復發率為20%～70%，約5%的病例可發生肉瘤樣惡變［1］。世界衛生組織將其定義為良惡性交界的骨腫瘤。GCTB影像學表現較為典型［2］，診斷并不存在困難，但化療對及放療的效果并不滿意，放射治療GCTB甚至可導致發病部位繼發肉瘤，因此對于GCTB的患者應慎重選擇化療與放療，臨床上多采用手術進行治療［3］。盡管早在2個世紀前已有學者描述此瘤的一些臨床特點，但是至今有關此瘤的相關基礎研究相比其它腫瘤仍非常少見，對其發生機制、生物學行為進行探索具有深遠的意義。

近年來腫瘤干細胞學說［4］的提出為腫瘤研究提供了新的思路。該學說認為腫瘤干細胞是存在于腫瘤組織中的一小部分具有干細胞性質的細胞群體，均具有自我更新能力和不定向分化潛能，并可導致腫瘤發生。現認為腫瘤干細胞是腫瘤形成及其不斷生長的根源。目前在結腸癌［5-6］、肝癌［7-9］、乳腺癌［10-13］等實體瘤中腫瘤干細胞相繼被發現分離，推動了腫瘤研究的進展。盡管越來越多的實體瘤干細胞被發現分離，但是這些實體瘤幾乎都是惡性實體瘤，關于良性或良惡性交界性腫瘤干細胞分離鑒定的研究鮮見報道。GCTB屬于良惡性交接性的原發骨腫瘤，其生物學特性不同于單純的良惡性腫瘤，此外，該腫瘤組成成分復雜，其腫瘤發生的具體機制也不十分明了，這些都給GCTB的研究帶來了難度。在本研究中，臨床標本原代培養獲取的GCTB細胞培養出了GCTB球體，并對該球體細胞進行了初步的功能學檢測，發現該球體細胞群具有干細胞樣特征，為將來進一步進行研究和臨床應用打下了基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑

DMEM/F12培養基(Gibco公司)，胎牛血清(Gibco公司)，堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF，Serotec公司)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF，Serotec公司)、胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factors-1，IGF-1，Serotec公司)，RNA提取試劑Trizol(Gibco公司)，反轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)試劑盒(TAKARA公司)，PCR引物(Invitrogen公司)，Transwell(BD公司)

1.2 原代培養和GCTB細胞系的建立

用于原代培養的手術標本來源于1位45歲的男性患者，該患者被診斷為C4椎體GCTB并在該院進行腫瘤切除手術。手術切除后的無菌新鮮標本一部分送往病理科進行病理學檢測證實為GCTB，另一部分標本裝入盛有Hank液的50 mL無菌離心管中立即送往細胞培養室進行后續的處置工作。在細胞超凈工作臺中將離心管中的標本倒入10 cm的無菌培養皿中，用Hank液反復沖洗，去除標本表面粘附的紅細胞，用無菌組織剪將組織塊反復剪切至糜狀，將組織移入裝有10 mL DMEM培養基的50 mL無菌離心管中，加入Ⅱ型膠原酶10 μL，同時加入青霉素(100 U/mL)，鏈霉素(100 mg/mL)，放入恒溫振蕩儀中在37℃的條件下以每分鐘200次的速度進行振蕩，2 h取出后用巴氏吸管將其吹打混勻，將組織懸液用400目(約37 μm)無菌金屬篩網中過篩，收集過篩后的液體，用巴氏吸管緊貼離心管沿其壁緩慢加入到預盛5 mL Ficoll淋巴細胞分離液的15 mL無菌離心管中，放入離心機中2500 r/min水平離心30 min。離心完畢后取出，將中間的細胞層小心用吸管吸出置入另一離心管中，5 mL磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffered saline，PBS)對其吹打、重懸，再次離心，去上清后底部即為分離所得的組織細胞。將經過上述處理獲得的細胞接種于25 cm2的細胞培養瓶中，加入含有20%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)、鏈霉素 (100 mg/mL)的DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)培養基，將細胞培養瓶放置在溫度設定為37℃、CO2濃度為5%的細胞培養箱中進行培養。每天用倒置相差顯微鏡定期觀察細胞生長情況，第3天進行半量換液1次。第5天進行全量換液1次。第7天用含有0.02%EDTA的0.25%胰酶將貼壁細胞消化后進行1∶2傳代。將傳代后的細胞接種于新的25 cm2的細胞培養瓶中，加入含有10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)，鏈霉素(100 mg/mL)的DMEM培養基進行培養。在培養的過程中，挑選不同代數的細胞進行凍存保種，收集細胞后將細胞用凍存液(90%胎牛血清，10%二甲基亞砜)重懸，將凍存管放入液氮罐中保存。

1.3 細胞增殖檢測

取對數生長期的原代細胞按3×103/孔接種于96孔培養板，每孔加200 μL含10%胎牛血清的DMEM，置5%CO2、飽和濕度37℃培養箱中培養，設3個復孔。每天加入20 μL CCK-8(Dojindo Laboratories，Kumamoto，Japan)試劑，37℃孵育2 h，使用多功能酶標儀檢測450 nm波長吸收值，連續檢測5 d。

1.4GCTB細胞球體誘導

將3×105個處于對數生長期的GCTB細胞培養在DMEM-F12培養基中(Gibco公司)，培養基中含青霉素100 U/mL，鏈霉素50 μg/mL，細胞置于超低吸附培養皿中(Corning)培養，在培養基中添加EGF(20 ng/mL)bFGF(20 ng/mL)，IGF(20 ng/mL)，于37℃含5%CO2的細胞培養箱中培養。隔1天添加1次生長因子，待5～7 d GCTB球體細胞體積較大時吸取培養基離心，用DMEM-F12培養基吹打成單細胞懸液，按1∶3比例傳代。

1.5 核心轉錄因子檢測(RAN抽提，RT-PCR)

①總RNA抽提:用無菌PBS清洗待測球體細胞2次;吸干殘液后，加1 mL Trizol裂解細胞;向細胞裂解液中加入200 μL氯仿，劇烈振蕩后，室溫下靜置10 min;4℃，12000 r/min，離心15 min;吸出含RNA的上層水相，移至另一離心管;加入與水等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫下靜置10 min;4℃，12000 r/min，離心10 min，令RNA沉淀;棄上清液，加入焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水配制的 75% 乙醇 1mL，洗滌 RNA;4℃ ，7500 r/min，離心8 min，棄上清液;RNA沉淀在空氣中干燥10 min，用40 μL DEPC水溶解;紫外分光光度儀測定濃度。②RNA逆轉錄合成 cDNA:將RNA稀釋到100 ng/μL，逆轉錄反應體系為5×PrimeScript?RT Master Mix(TAKARA)2 μL，RNA 5 μL，RNase Free dH2O 3 μL。逆轉錄產物 1∶40 稀釋后備用。③real time PCR:反應體系為:2×PreMix(TAKARA)5 μL;Primers(Pairs)1 μL;Rox 0.2 μL;cDNA 3.8 μL。擴增條件:預變性 95℃15 s;95℃ 5 s，60℃ 31 s，共40個循環。反應中使用的引物為Primer Premier 5.0軟件設計(見表1)。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.6 侵襲實驗

Transwell、24孔培養板、Matrigel置于4℃ 冰箱過夜，將Transwell置于24孔板中，Matrigel和無血清DMEM培養基按1∶5比例混合，取60 μL加入Transwell上室，37℃溫育2 h以使其凝固。將GCTB原代細胞和球體細胞用無血清DMEM培養基制備成單細胞懸液，與上室中加入200 μL細胞懸液(1×105個細胞)，下室中加入800 μL含10%胎牛血清的DMEM培養基，每室設3個對照;于37℃、5%CO2的條件中培養24 h，取出上室，用結晶紫染色，用棉簽擦除未能侵襲的細胞，于200倍光鏡下，隨機選取4個視野拍照，計數細胞進行比較。

1.7 動物實驗

裸鼠用1%戊巴比妥鈉(75 mg/kg)麻醉，仰臥位，膠帶固定前肢及左后肢，使右后肢屈曲，脛股骨夾角成45°，然后手持1 mL TB針筒29 G針頭刺入脛股骨關節間隙，從脛骨頭關節窩凹點處進針，順著脛骨骨干長軸方向緩慢鉆透脛骨頭松質骨部分進入骨髓腔，有明顯的突破感。旋轉緩慢進入擴髓，退出針頭后沿原進針點用微量進樣器插入骨髓腔，緩緩注入用Matrigel膠與DMEM1∶1配制的GCTB球體細胞懸液20 μL，約5×105個細胞，最后拔出針頭。待裸鼠蘇醒后回籠。對側注射同體積Matrigel膠與DMEM含1×106GCTB親代細胞作為對照。后每周定期用動物X線機(Kodak，DXS4000 Pro system)觀察腫瘤生長情況。

2 結 果

2.1 原代細胞培養及生長曲線

細胞懸液接種24 h后，開始可以觀察到貼壁細胞，這些細胞大小、形態不一，主要可以看到形態巨大的多核巨細胞和梭形的基質細胞，其中多核細胞細胞核排列緊密，梭形細胞大小不一，形態多樣，核體積增大，核漿比例失調。經過連續3次傳代以后，多核巨細胞基本在視野中消失，只能觀測到梭形的基質細胞(見圖1)。連續5 d檢測細胞的生長情況，得到原代細胞的生長曲線(見圖2)。

圖1 原代細胞(×100)Fig.1 Primary cell(×100)

圖2 生長曲線Fig.2 Growth curve

2.2 細胞球體形成

腫瘤干細胞在無血清特殊培養條件下具有形成球體的能力，因此培養球體細胞可以成為富集干細胞的手段之一。將GCTB細胞培養在含有生長因子的DMEM/F12培養基中，發現培養5 d后GCTB細胞形成了球體(見圖3)。

2.3 干細胞相關核心轉錄因子檢測

在原代GCTB細胞和培養的球體細胞中同時用real-time PCR檢測了干細胞自我更新相關的基因OCT4、SOX2和NANOG的表達情況。實驗結果發現，與原代細胞相比，GCTB球體細胞中OCT4、Sox2和NANOG的mRNA表達都是明顯上調的(見圖4)，特別是OCT4，其在球體細胞中mRNA的含量是原代細胞中含量的49倍。這些結果表明培養形成的球體細胞具有一定的干細胞特性。

圖3 球體形成(×200)Fig.3 Development of sphere(×200)

圖4 干細胞相關核心轉錄因子real-time PCR檢測Fig.4 Real-Time PCR for the detection of“stemness”-associated core transcription factors

2.4 侵襲實驗

通過transwell侵襲實驗檢測GCTB球體細胞的侵襲性，實驗結果發現GCTB球體細胞的侵襲性明顯強于GCTB原代細胞(見圖5)，2組間差異具有統計學意義(P ＜0.01)。

圖5 侵襲實驗Fig.5 Invasion sssay

2.5 動物實驗

在進行GCTB細胞骨腔注射后4周后對小鼠進行了X線檢測，發現實驗組中骨近端出現骨質破壞(見圖6箭頭所指位置)，而對照組骨質密度連續均一，皮質完整，提示GCTB球體細胞在骨環境中比GCTB親代細胞具有更強的致瘤能力。

圖5 GCTB細胞注射4周后小鼠脛骨X線檢測結果Fig.5 X-ray films 4 weeks after GCTB cells transplant

3 討 論

目前的腫瘤干細胞的相關研究多聚焦于惡性腫瘤，很少有良性腫瘤干細胞的研究報道。其原因在于良性腫瘤的危害性要小于惡性腫瘤，良性腫瘤或交界性腫瘤的相關研究不像惡性腫瘤研究那樣深入，那么良性腫瘤中是否存在腫瘤干細胞?筆者認為如果說腫瘤起源于腫瘤干細胞的話，那么不管是良性腫瘤還是惡性腫瘤都應該存在腫瘤干細胞。另外，就腫瘤的異質性這個特點來講，不同類型的腫瘤細胞成瘤能力也就會存在差異，那么也必然會有某一類群細胞成瘤能力最強。所以這一亞群就也可以被稱為腫瘤干細胞，但是由于良性腫瘤同惡性腫瘤生物學特性方面有很大差異，比如說極少出現轉移，而惡性腫瘤中目前有很多研究認為是某個亞群的腫瘤干細胞決定了是否轉移，如果良性腫瘤中存在腫瘤干細胞，為何轉移極為罕見?這些都是需要漫長的探索研究才能解決的問題。本研究僅是對GCTB干細胞進行了初探。

腫瘤干細胞研究的首要問題就是分離鑒定，但是由于缺乏特異的標志物，腫瘤干細胞的分離純化一直是各國科學家亟待解決的難題之一。到目前為止已經報道了很多腫瘤干細胞表面標志物，例如CD133是一個報道很多的腫瘤干細胞表面標志物，在多種實體瘤干細胞中都有報道［14-18］。也有學者用分選側群細胞的方法來得到腫瘤干細胞。側群細胞最初用來從鼠骨髓中分選造血干細胞［19］。目前已經發現在成神經細胞瘤細胞系［20］、肝癌［21］和卵巢癌［22］中也發現有側群細胞。

與上面的用標志物法來分離鑒定腫瘤干細胞的方法相比，球體培養是更簡單易行的方法。研究發現，干細胞能夠懸浮生長或在半固體培養基中生長，而普通細胞不附著于固體表面就不能生長。這可能是由干細胞非附著性生長的特性決定的，其確切的機制目前尚不明確。腫瘤干細胞也具有這種特性。在腦腫瘤與乳腺癌的研究中發現，腦腫瘤中的CD133+ 細胞［15］與乳腺癌中的 CD44+、CD24-細胞［11］均可在無血清培養基形成細胞球及在軟瓊脂中形成克隆，這是鑒定其是否具有自我更新能力的重要步驟，也是腦腫瘤及乳腺癌腫瘤干細胞的一個重要特性。本實驗利用了這個特性富集干細胞，所培養的GCTB球體細胞中OCT4、SOX2和NANOG的mRNA水平與原代細胞相比都是明顯上調的。OCT4、SOX2和NANOG是調控胚胎干細胞自我更新和維持其全能性的三個核心轉錄因子，能維持胚胎干細胞正常的未分化狀態并促進其增殖，而親代細胞株這三種蛋白表達很低［23-24］。本研究中培養的GCTB球體細胞中OCT4、SOX2和NANOG明顯上調，說明球體細胞是具有一定干細胞特性的。

腫瘤干細胞的來源一直是有爭議的問題，GCTB的組成成分復雜，除了多核巨細胞外，基質細胞有2種，一種為成纖維細胞樣基質細胞;另一種為巨噬細胞樣基質細胞。體外培養發現，巨噬細胞樣基質細胞在原代培養中可占10% ～40%，經傳代后逐漸減少，最后只剩下梭形排列的成纖維細胞樣基質細胞。至于基質細胞的起源，有學者認為對腫瘤性質起決定作用的成纖維細胞樣基質細胞來自于骨髓的原始間葉組織，而巨噬細胞樣基質細胞系單核巨噬系統來源，代表機體的免疫反應。本研究中用到的都是來源于亞洲GCTB患者的GCTB細胞系，所有的手術標本在原代培養早期可以看到細胞在培養瓶中仍然保持與病理切片一致的形態，即以多核巨細胞為中心，周圍圍繞基質細胞，但在傳代后，多核巨細胞逐漸消失，視野中只能看見梭形的基質細胞，以1×108此種基質細胞對免疫缺陷小鼠進行注射已經可以致瘤，對基質細胞進行懸浮無血清培養能夠誘導成球，后來的球體細胞正是來源于此。這證明GCTB對腫瘤的致瘤能力和侵襲能力起重要作用的是基質細胞。值得注意的是以單一形態的基質細胞進行小鼠致瘤的標本，取出后進行切片可以再次看見GCTB的典型病理形態。說明多核巨細胞在體外培養時缺乏體內內環境的調控而消失或者可能是裂變成單核的基質細胞，而重新注入免疫小鼠體內后，基質細胞再次分裂或多個細胞聚合形成多核巨細胞，說明基質細胞在GCTB的發生發展中起著主導作用，其發生機制還需用示蹤學的相關方法或手段進一步研究。

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