紫貽貝酸性磷酸酶綜合性和設計性實驗的開設

于樂軍　劉晨光　李立德

摘 要 開設綜合性、設計性實驗，提高學生的動手能力和創新意識，已成為當前實驗教學改革的總體趨勢。就中國海洋大學酶工程實驗開設的酸性磷酸酶綜合性和設計性實驗，從選題依據、實驗設計安排、實驗內容關鍵點、實驗設計心得等5個方面進行介紹。本實驗取材經濟方便，操作簡單易行，適合于東部沿海相關大專院校本科酶學實驗教學。

關鍵詞 紫貽貝；綜合性實驗；設計性實驗；酸性磷酸酶

中圖分類號：G642.423 文獻標識碼：B

文章編號：1671-489X（2014）04-0106-03

酶工程是中國海洋大學生命專業生物科學及生物技術專業學生的專業選修課，經過幾年的發展，已經形成了學校獨特的教學理念及內容。實驗教學一直被認為是理論教學最好的補充，是聯系理論與實踐的橋梁[1]。但由于種種原因，中國海洋大學酶工程實驗教學一直處于空白狀態。雖然生物化學實驗課也開設了有關酶學方面的實驗，但遠遠不能滿足學生對于知識的渴求，以及學校加強實踐教學的要求。為此，經過反復討論與實驗，為選修酶工程實驗的學生開設了酸性磷酸酶綜合性和設計性實驗。現將相關實驗內容介紹如下，希望為相關院校開設綜合性及設計性實驗提供一些可供借鑒的經驗及內容。

1 選題依據

中國海洋大學是一所以海洋和水產為特色的綜合性大學，正朝著建設特色顯著的高水平研究型大學高速前行。為彰顯學科特色，選擇海洋生物——紫貽貝作為實驗材料。紫貽貝俗稱海紅、淡菜，是廣泛分布于我國東部沿海的一種常見貝類，其肉味鮮美，營養價值高，且價格便宜，成本低。組織學及組織化學研究發現[2]，紫貽貝消化腺中含有多種酶類，又尤以酸性磷酸酶（acid phosphatase EC3.1.3.2，ACP）的活性較高。酸性磷酸酶是一種在酸性條件下催化磷酸單酯水解生成無機磷酸的水解酶，是溶酶體的標志酶，而溶酶體的基本功能是對生物大分子的強烈消化作用，以維持細胞的正常代謝活動。在臨床上，酸性磷酸酶測定主要用于前列腺癌等疾病的輔助診斷。因此，對酸性磷酸酶的研究不但對于紫貽貝的養殖有一定的意義，并且對于人體一些疾病的診斷和預防也能起到積極的作用。

另外，實驗前期，以紫貽貝酸性磷酸酶分離純化為主要內容的兩項本科生SRDP項目已對紫貽貝酸性磷酸酶的提取、分離純化及其酶學性質進行了初步的研究，實驗過程充分展示了本實驗的良好再現性，并且通過驗收順利結題，這也為本實驗能順利開展提供了良好的理論及實踐基礎。

2 實驗設計安排

近幾年來，由于教育部《關于進一步加強高等學校本科教學工作的若干意見》中明確提出了“積極推動研究性教學，提高大學生的創新能力，增加綜合性與創新性實驗”的要求，許多地方高校在其專業實驗中不同程度地開設了綜合性和設計性實驗，但往往兩者之間相互獨立，自成體系，只能發揮其單一的作用。將綜合性和設計性實驗有機地結合在一起，不僅能使實驗前后連貫，成為一個整體，而且將有助于兩者共同發揮作用，起到“1+1>2”的效果。因此，本實驗設計遵從這一原則，在綜合性實驗后安排設計性實驗，設計性實驗是綜合實驗的延伸和拓展，實驗前后連貫，構成一個整體。

先用苯酚作出酚標準曲線，然后在35 ℃下，將酶液加入盛有磷酸苯二鈉溶液的試管中，精確反應10 min，加入1 mol/L碳酸鈉溶液終止反應，再加入Folin-酚試劑，35 ℃精確反應10 min，同時以不加酶液，但反應條件一致的另一試管作為空白對照，測定在OD680 nm下的吸光度。由標準曲線公式計算出樣品吸光度所對應的結晶酚濃度，通過相應公式計算酶活力。

蛋白質含量測定采用考馬斯亮藍G250染色法測定。考馬斯亮藍在一定蛋白質濃度范圍內，蛋白質和染料結合符合比爾定律，因此可以通過測定染料在595 nm處光吸收的增加量得到與其結合的蛋白質量。該法簡單、迅速、干擾物質少、靈敏度高。

酸性磷酸酶米氏常數Km的測定 測定Km和Vm，特別是測定Km，是酶學工作的基本內容之一。在酶動力學性質的分析中，米氏常數Km是酶的一個基本特性常數，它包含著酶與底物結合和解離的性質。米氏常數的測定一般通過作圖法求得。作圖方法很多，其共同特點是先將米氏方程式變換成直線方程，然后通過作圖法求得。本實驗采用最常用的雙倒數作圖法（Lineweaver-Burk作圖法）求得。

酸性磷酸酶凝膠過濾柱層析 凝膠過濾層析也稱分子篩層析、排阻層析，是利用具有網狀結構的凝膠的分子篩作用，根據被分離物質的分子大小不同來進行分離的一種層析方法。本實驗選取葡聚糖凝膠Sephadex G-150作為凝膠填料，用0.01 mol/L醋酸緩沖液作為洗脫液進行凝膠過濾柱層析。

酸性磷酸酶凝膠電泳 酸性磷酸酶凝膠電泳采用SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝膠）垂直板電泳，濃縮膠和分離膠濃度分別為5%和10%，其中關鍵的樣品溶解緩沖液體系包括：1.0 mol/L，pH6.8 Tris-HCl緩沖液0.5 ml、甘油0.8 ml、10% SDS 1.6 ml、2-巰基乙醇0.4 ml、0.05%溴酚藍0.2 ml和蒸餾水（雙蒸水）4.5 ml，總體積8 ml[3]。

酸性磷酸酶固定化 綜合實驗中酶固定化采用物理吸附法，使用活性炭作為吸附劑，將酶液吸附后，經離心得到的沉淀即為固定化酶。設計實驗中要求學生以來源于海洋生物的兩種材料——海藻酸鈉和殼聚糖為固定化材料，設計酶固定化實驗。

酸性磷酸酶性質研究 設計實驗酸性磷酸酶性質研究主要包括溫度、pH值、熱穩定性、金屬離子、化學修飾劑對酶活力的影響。要求每組學生至少設計兩種因素對酶活力的影響，并且各組間盡量不要重合。

4 實驗設計心得

1）本實驗設計是以酸性磷酸酶為主線，運用了離心、分光光度、層析技術、電泳技術、透析等酶工程相關專業技術對紫貽貝酸性磷酸酶進行提取、分離純化到固定化的綜合性實驗，并在綜合實驗的基礎上開設兩個設計性實驗。設計性實驗不是獨立于整個實驗體系外，而是整個體系的延伸和拓展，使整個實驗過程前后連貫，構成一個完整的整體。這樣將綜合性實驗與設計性實驗有機地結合起來，不僅有利于培養學生的實驗動手能力和綜合分析能力，而且有利于培養學生的創新能力及創新意識，更有利于調動學生對酶工程實驗的積極性及主動性，從而達到“1+1>2”的效果。

另外，設計性實驗與綜合性實驗構成一個整體，也使得學生在查閱相關資料、設計實驗方案時有的放矢，提高設計方案的可行性，為取得良好的實驗效果奠定基礎。

2）本實驗的實施采用“開放自主式”的實驗模式。開放自主式實驗教學能使學生從“被動、封閉、受束縛”的狀態變成“主動、開放、較自由”的狀態，真正地成為實驗的主人、教學的主體，充分地鍛煉了學生“大腦”和“雙手”[4]。由于中國海洋大學基礎實驗中心實驗室采用門禁系統管理，因此將學生的智能卡開卡后，學生可隨時進入實驗室實驗，這就保證了實驗室全天候的開放。在規定的時間內，學生從實驗材料的購買、實驗試劑的配制、實驗儀器的組裝，到設計性實驗的方案設計、實驗的操作，都自主完成，教師只起到掌控全局、適時指導和適當監督的作用[5]。

3）實驗分成若干個小組，并且采取組長負責制。由于本次大實驗的實施是在學生上課階段，因此不是每個學生都有時間在同一時間內做實驗。這就要求組長進行協調和分配，整個小組成員相互協作，做好實驗計劃安排，保證實驗在規定的時間內高質量、高水平地完成。同時也鍛煉了學生在組織協調及相互協作方面的能力。

4）在酶學固定化實驗設計中，海藻酸鈉和殼聚糖兩種材料可單獨作為包埋材料進行實驗設計，也可兩種材料結合起來，設計兩種材料的復合微球。最后，將幾種固定化酶的效果進行比較，這樣做不僅使學生更加直觀地掌握了幾種固定化方法，而且有利于提高學生在綜合知識方面的能力。

5）實驗安排時，不是簡單地羅列出實驗步驟，而是在每個實驗后面附有2～3個思考題。比如在酶活測定時，思考題為：如果用定磷法設計酶活實驗，該如何設計？再如在酶的凝膠電泳時，思考題為：如果樣品不用還原劑處理，電泳結果將會如何？這些問題的提出，有助于學生主動去思考問題、解決問題，并將其更好地應用于實驗中，調動學生對實驗的積極性和主動性。

5 結束語

隨著各高校對教育部《關于進一步加強高等學校本科教學工作的若干意見》的進一步落實，開設綜合性、設計性實驗，提高學生的動手能力和創新意識，已成為當前實驗教學改革的總體趨勢[6-8]。綜合性和設計性實驗總體方案的設計應該具有連貫性、系統性、科學性和實用性，并且要經常在原有基礎上拓展新的實驗項目。只有這樣，才能不斷調動學生對實驗的積極性和主動性，培養學生的創新意識和創新精神。

未來，還要在本實驗的基礎上，進一步深化和拓展，比如酶的克隆與表達、酶的定向進化、酶的中試生產、酶的應用等方面，力爭使本綜合性設計性實驗涵蓋酶工程上、中、下游的各個方面，為國家和社會培養具有專業酶工程知識和技術的高素質人才。

參考文獻

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