弓形蟲速殖子感染對HeLa細胞凋亡的影響

沈進，陳穎婷，吳亮，吳臘梅，王曉，陳盛霞，曹建平

（1．江蘇大學醫學院，江蘇鎮江212013；2．中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所，上海200025）

弓形蟲速殖子感染對HeLa細胞凋亡的影響

沈進1，陳穎婷1，吳亮1，吳臘梅1，王曉1，陳盛霞1，曹建平2

（1．江蘇大學醫學院，江蘇鎮江212013；2．中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所，上海200025）

目的：探討不同數量弓形蟲速殖子感染對HeLa細胞凋亡的影響。方法：24孔板培養HeLa細胞16 h，各孔接種不同數量弓形蟲速殖子繼續培養4 h，在培養液中加入終質量濃度為0．5μg／mL放線菌素D誘導凋亡，于加放線菌素D后8、12、24、36 h收集細胞，采用Hoechst 33258染色法和Annexin V-FITC／PI細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡率。結果：當蟲體量／細胞量（MOI）≤1時，弓形蟲感染表現為抑制放線菌素D誘導的HeLa細胞凋亡；隨著蟲體數量增加（MOI＞1）和感染時間延長（≥24 h），蟲體感染則表現為促進HeLa細胞凋亡。結論：弓形蟲感染可影響體外培養的HeLa細胞的凋亡，影響程度與感染蟲體數量相關。

剛地弓形蟲；細胞凋亡；HeLa細胞；放線菌素D

弓形蟲（Toxoplasma gondii）是一種專性細胞內寄生原蟲，幾乎可感染包括人類在內的所有哺乳動物。全球近1／3人口被弓形蟲感染［1］，免疫功能正常者感染后不會出現明顯癥狀，但免疫功能降低或缺陷者感染后可引起嚴重的并發癥。目前弓形蟲病已成為器官移植和獲得性免疫缺陷綜合征患者死亡的主要原因之一［2］。凋亡是在一定的生理和病理情況下，機體為維護內環境穩定，通過基因調控使細胞自動消亡的過程，在維持組織、器官的正常形態和功能方面起著重要作用［3］。此外，凋亡還有助于宿主抵抗病原微生物的入侵，抑制病原體在細胞內增殖，保護未感染細胞并減少宿主細胞損傷，在宿主抗感染過程中發揮重要作用［4］。關于弓形蟲調控宿主細胞凋亡能力的研究結果并不完全一致［5－8］。目前仍缺乏不同蟲體感染量和不同感染時間條件下，蟲體抑制宿主細胞凋亡能力的研究。因此，本研究探討不同數量弓形蟲對放線菌素D誘導的HeLa細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1．1 材料

弓形蟲RH株由本室液氮冷凍保存，長期傳代于人宮頸癌HeLa細胞。HeLa細胞購自中國科學院細胞庫；RPMI 1640細胞培養液購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；新生牛血清和胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；Hoechst 33258染色液為美國Sigma公司產品；Annexin V-FITC／PI細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司；放線菌素D為美國Sigma公司產品。

1．2 方法

1．2．1 HeLa細胞和弓形蟲速殖子的培養 將He-La細胞置于含10%新生牛血清的RPMI 1640培養液（以下簡稱細胞培養液），待細胞生長至完全融合，以胰酶消化液（含0．25%胰酶和0．02%EDTA）消化傳代。速殖子培養時，選取生長融合至單細胞層的HeLa細胞，培養液更換為含1%胎牛血清RPMI 1640（以下簡稱速殖子培養液），繼續培養12 h后接種適量弓形蟲速殖子，4 h后換新鮮速殖子培養液繼續培養至蟲體漲破細胞，收集蟲體用于后續實驗。

1．2．2 Hoechst33258染色觀察細胞凋亡率 24孔板內每孔接種1．5×105個HeLa細胞并培養16 h，按不同蟲體量／細胞量（multiplicity of infection，MOI）比值（MOI分別為0．1、1、5和10）分別接種速殖子，感染后4 h更換新速殖子培養液，加入終質量濃度為0．5μg／mL的放線菌素D誘導凋亡，分別于8、12、24、36 h吸棄24孔板內舊培養液，各孔加入500μL甲醇，冰上固定5 min。棄去甲醇，PBS緩沖液洗滌2次后，各孔加入500μL Hoechst 33258工作液（5μg／mL），37℃染色15 min。棄染色液，PBS緩沖液洗滌2次后各孔加入300μL甘油，置于熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況并照相記錄，用Image Pro軟件分析凋亡率。同時設置放線菌素D誘導對照組，各組平行重復3次。

1．2．3 Annexin V-FITC／PI檢測細胞凋亡率 24孔板內每孔接種1．5×105個HeLa細胞，培養16 h，感染不同數量速殖子（MOI分別為0．1、1、5和10）。感染后4 h更換新速殖子培養液，加入終質量濃度為0．5μg／mL的放線菌素D誘導凋亡，分別于8、12、24、36 h收集細胞，PBS緩沖液洗滌2次，加入500μL結合緩沖液重懸細胞，并分別加入5μL Annexin V-FITC和5μL碘化丙啶充分混勻，室溫下避光反應15 min，通過流式細胞儀檢測細胞早期凋亡率和晚期凋亡率。同時設置放線菌素D誘導對照組，各組平行重復3次。

1．3 統計學分析

2 結果

2．1 Hoechst33258法檢測HeLa細胞凋亡率

不同數量速殖子感染HeLa細胞8、24、36 h時，MOI＝0．1組和MOI＝1組細胞凋亡率均小于放線菌素D誘導的對照組，但差異無統計學意義；僅在感染12 h時，細胞凋亡率明顯低于對照組（P＜0．05）；隨著速殖子量的增加，MOI＝5組和MOI＝10組不同時間點細胞凋亡率明顯高于對照組（P＜0．05），僅MOI＝5組感染12 h時的凋亡率與對照組差異無統計學意義。見圖1和表1。

表1 Hoechst 33258染色法檢測不同數量速殖子感染不同時間后HeLa細胞凋亡率 %±s

a：P＜0．05，與對照組比較

分組4．77±0．81 7．33±0．92 6．67±1．26 15．09±4．35 MOI＝0．1 3．34±0．61 2．81±0．49a 5．39±1．66 11．71±3．38 MOI＝1 3．67±1．14 3．06±0．29a 6．32±2．67 11．57±2．77 MOI＝5 8．15±1．74a 7．16±1．59 15．50±4．01a 21．63±5．40a MOI＝10 8．27±2．18a 9．09±1．62a 16．97±5．23a 25．92±8．72a F值8 h 12 h 24 h 36 h對照組＜0．05 ＜0．05 ＜0．05 ＜0．05 22．85 49．78 21．44 7．76 P值

2．2 Annexin V-FITC／PI法檢測的細胞凋亡率

不同數量速殖子感染HeLa細胞8 h時，各感染組細胞凋亡率與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0．05）；感染12、24 h時，隨著速殖子量的增加和時間的延長，與對照組比較，各組細胞凋亡率先降低再增加；感染36 h時隨著速殖子數量增加，細胞凋亡率逐漸降低。見圖2和表2。

表2 Annexin V-FITC試劑盒法檢測不同數量速殖子感染各組HeLa細胞凋亡率 %±s

a：P＜0．05，與對照組比較

8 h 12 h 24 h 36 h對照組 11．33±0．32 36．87±0．85 30．05±0．97 25．40±0．5分組7 MOI＝0．1 11．12±0．21 28．5±0．78a 40．66±6．48 22．68±0．45a MOI＝1 13．30±2．35 24．74±0．41a 45．87±5．93a 20．03±1．04a MOI＝5 14．83±2．34 37．22±0．24a 51．35±0．59a 4．85±0．66a MOI＝10 12．53±1．35 50．4±0．64a 60．32±2．47a 4．08±0．18a F值0．89 ＜0．05 ＜0．05 ＜0．05 0．27 328．47 43．82 376．40 P值

3 討論

弓形蟲抑制被感染細胞凋亡的生物學意義在于為其自身增殖提供一個理想環境，這已成為各國研究者的共識［9］。本研究結果表明，較低數量弓形蟲速殖子感染（MOI≤1）可以明顯抑制HeLa細胞凋亡，但當速殖子數量較多時（MOI＞1）或感染時間超過24 h時，速殖子感染促進被感染細胞凋亡。

凋亡是細胞的基本生物學現象，在機體免疫應答中起著重要作用。眾多胞內寄生病原體，如細菌［10］、病毒［11］和原蟲［12］的感染都會抑制宿主細胞凋亡。這些病原體通過抑制細胞凋亡，避免被感染細胞連同病原體一并被宿主吞噬細胞清除，實現了逃避宿主細胞毒性T細胞和NK細胞介導的細胞毒作用，改變了宿主免疫進程，為病原體在宿主細胞內的生存創造了有利的環境［13－14］。

放線菌素D是一種常用的細胞凋亡誘導劑，通過嵌入DNA雙螺旋的小溝中，與DNA形成復合體，導致細胞RNA聚合酶無法正常發揮功能，阻斷RNA轉錄，同時啟動細胞凋亡級聯反應，從而誘導細胞凋亡的發生。本研究表明，較少量的蟲體（MOI≤1）在感染早期（＜24 h）能夠抑制由放線菌素D誘導的HeLa細胞凋亡，與Nash等［6］報道的弓形蟲抑制由放線菌素D誘導的巨噬細胞凋亡，以及Goebel等［15］報道弓形蟲抑制由放線菌素D誘導的人早幼粒白血病細胞（HL-60）凋亡的實驗結果相似。

本研究分別采用了Hoechst 33258染色法和Annexin V-FITC／PI法檢測細胞凋亡。其中，Hoechst 33258染色法通過凋亡小體鑒別凋亡細胞，此法需預先固定細胞，染色后需用緩沖液反復洗滌以除去多余染料，該過程可能會引起部分凋亡細胞從培養板上脫落，最終造成細胞凋亡率的偏低。同時，細胞在凋亡和有絲分裂時都會發生染色質濃縮，在熒光顯微鏡下呈現明亮的光點，易造成對細胞凋亡的誤判［16］。Annexin V-FITC／PI法中Annexin V是一種磷脂結合蛋白，對細胞表面凋亡特異性標志物磷脂酰絲氨酸具有高度親和力，可以特異性地檢測出凋亡細胞，消除了有絲分裂相細胞的干擾。該方法是收集細胞培養板內所有細胞進行檢測，避免了由于染色洗滌等操作造成的細胞脫落。另外，Annexin V-FITC／PI法檢測HeLa細胞凋亡時，我們發現放線菌素D處理36 h，MOI＝5和MOI＝10組的細胞凋亡率出現急劇降低。結合Annexin V-FITC／PI法中細胞PI染料檢測結果，我們認為大量細胞死亡是造成細胞凋亡率急劇降低的主要原因。

研究中我們還發現，當MOI＞1或放線菌素D處理時間≥24 h時，速殖子感染細胞后表現為促進細胞凋亡。武欣等［17］研究弓形蟲對MCF-7乳腺癌細胞、DU-145前列腺癌細胞、EC-109食管癌細胞和A549肺癌細胞增殖及凋亡的影響后也獲得類似結果，表明弓形蟲速殖子并非只是簡單地抑制或促進細胞凋亡，可能是通過相當復雜的機制調控細胞的增殖和凋亡。本研究結果表明，弓形蟲速殖子感染影響細胞凋亡存在著數量-效應關系和時間-效應關系，但其調控機制有待于進一步研究。

［1］ Tenter AM，Heckeroth AR，Weiss LM．Toxoplasma gondii：from animals to humans［J］．Int JParasitol，2000，30（12／13）：1217－1258．

［2］ Fleige T，Limenitakis J，Soldati-Favre D．Apicoplast：keep it or leave it［J］．Microbes Infect，2010，12（4）：253－262．

［3］ 徐軍，孫新，楊小迪，等．弓形蟲感染小鼠血清對小鼠B16黑色素瘤細胞增殖和凋亡的影響［J］．中國病原生物學雜志，2009，4（3）：202－205．

［4］ DosReis GA，Barcinski MA．Apoptosis and parasitism：from the parasite to the host immune response［J］．Adv Parasitol，2001，49：133－161．

［5］ Goebel S，Gross U，Lüder CG．Inhibition of host cell apoptosis by Toxoplasma gondii is accompanied by reduced activation of the caspase cascade and alterations of poly（ADP-ribose）polymerase expression［J］．J Cell Sci，2001，114（Pt19）：3495－3505．

［6］ Nash PB，Purner MB，Leon RP，et al．Toxoplasma gondii-infected cells are resistant tomultiple inducers of apoptosis［J］．J Immunol，1998，160（4）：1824－1830．

［7］ 黃開順，黃天利，葛璞，等．剛地弓形蟲培養上清對人肝癌細胞HepG2增殖及凋亡的作用［J］．激光雜志，2013，34（1）：98－101．

［8］ 高劍，葉彬，武衛華．剛地弓形蟲細胞培養上清對人結腸癌細胞sw480增殖與凋亡的影響［J］．中國人獸共患病學報，2010，26（3）：229－234．

［9］ 趙蕾，陳建雙．細胞凋亡在醫學寄生蟲學領域的研究進展［J］．承德醫學院學報，2006，23（3）：299－301．

［10］ Ashida H，Mimuro H，Ogawa M，etal．Cell death and infection：a double-edged sword for hostand pathogen survival［J］．JCell Biol，2011，195（6）：931－942．

［11］ Roulston A，Marcellus RC，Branton PE．Viruses and apoptosis［J］．Annu Rev Microbiol，1999，53（1）：577－628．

［12］ Heussler VT，Kuenzi P，Rottenberg S．Inhibition of apoptosis by intracellular protozoan parasites［J］．Int JParasitol，2001，31（11）：1166－1176．

［13］ Lang C，Gross U，Lüder CG．Subversion of innate and adaptive immune responses by Toxoplasma gondii［J］．Parasitol Res，2007，100（2）：191－203．

［14］ Filisetti D，Candolfi E．Immune response to Toxoplasma gondii［J］．Ann Ist Super Sanita，2004，40（1）：71－80．

［15］ Goebel S，Luder CG，Gross U．Invasion by Toxoplasma gondii protects human-derived HL-60 cells from actinomycin D-induced apoptosis［J］．Med Microbiol Immunol，1999，187（4）：221－226．

［16］ Negoescu A，Guillermet C，Lorimier P，et al．Importance of DNA fragmentation in apoptosiswith regard to TUNEL specificity［J］．Biomed Pharmacother，1998，52（6）：252－258．

［17］ 武欣，孫黎，張力，等．弓形蟲對4種腫瘤細胞增殖及凋亡的影響［J］．中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，2012，30（2）：157－159．

Effect of Toxoplasma gondii tachyzoite infection on HeLa cell apoptosis

SHEN Jin1，CHEN Ying-ting1，WU Liang1，WU La-mei1，WANG Xiao1，CHEN Sheng-xia1，CAO Jian-pin2
（1．School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013；2．National Institute of Parasitic Diseases，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Shanghai200025，China）

Objective：To explore HeLa cell apoptosiswhen infected with different number of T．gondii tachyzoites．M ethods：HeLa cells were cultured in 24-wells plates for 16 h and incubated with different number of T．gondii tachyzoites．After infected for 4 h，the concentration of0．5μg／mL actinomycin D was added into themedium．The cellswere collected in 8，12，24 and 36 h．The apoptosis of HeLa cell was determined by Hoechst33258 stain and Annexin V-FITC／PImethod．Results：When the rate of parasites／cells（multiplicity of infection，MOI）was nomore than 1（MOI≤1），the parasites could suppress the cell apoptosis．When MOI＞1 and the infection time over 24 h，the parasites could accelerate the cells apoptosis．Conclusion：T．gondii tachyzoite infection could affect the HeLa cell appotosis in vitro，and the incidence was related to the number of tachyzoites．

Toxoplasma gondii；cell apoptosis；HeLa cells；actinomycin D

R382．5

A

1671－7783（2014）05－0399－04

10．13312／j．issn．1671-7783．y140060

國家自然科學基金資助項目（81301453）；衛生部寄生蟲病原與媒介生物學重點實驗室開放課題（WSBKTKT201302）；江蘇大學高級人才啟動基金資助項目（13JDG023，13JDG127）；江蘇省研究生創新計劃資助項目（CX10B＿282Z）

沈進（1991—），男，碩士研究生；陳盛霞（通訊作者），教授，博士生導師，E-mail：chensxia＠ujs．edu．cn

2014－03－23 ［編輯］ 陳海林