不同灸量艾灸對克羅恩病大鼠結腸組織損傷積分和血清IgG、IgA、IgM水平的影響*

王莖，夏曉紅，葉敏，江莉，吳思丹

（安徽中醫學院，合肥 230038）

不同灸量艾灸對克羅恩病大鼠結腸組織損傷積分和血清IgG、IgA、IgM水平的影響*

王莖，夏曉紅，葉敏，江莉，吳思丹

（安徽中醫學院，合肥 230038）

[目的]觀察不同灸量艾灸對克羅恩病（CD）大鼠結腸組織損傷積分和血清免疫球蛋白IgG、IgA、IgM水平的影響。[方法]將45只SD大鼠隨機分成正常組、模型組、艾灸A組、艾灸B組和艾灸C組共5組，每組9只。采用三硝基苯磺酸（TNBS）液灌腸制備大鼠CD模型，造模后每組隨機取1只進行模型判定。艾灸A組：艾條溫和灸雙側“天樞”穴，用小艾條點燃后，在穴位上方1～2 cm處溫和灸5 min，每日1次，共灸治14 d；艾灸B組：方法同艾灸A組，每次艾灸時間為15 min，共治療14 d；艾灸C組：方法同艾灸A組，每次艾灸時間為25 min，共治療14 d；模型組和正常組僅做相同固定，不做治療。治療結束后剖取結腸組織，蘇木精-伊紅染色（HE）法觀察大鼠結腸組織病理學變化，計算結腸組織損傷積分；經腹主動脈取血檢測大鼠血清IgG、IgA、IgM水平。[結果]每組取8只進入結果分析。模型組大鼠結腸組織損傷積分以及血清IgG、IgA、IgM水平明顯上升（P＜0.01）；艾灸均能降低CD大鼠結腸組織損傷積分以及血清IgG、IgA、IgM水平，但灸治5 min效果不顯，灸治15 min和灸治25 min作用相同，差異無統計學意義（P＞0.01）。[結論]合適的灸量能顯著降低血清IgG、IgA、IgM水平，調節免疫水平，抑制CD過激的免疫反應，從而減輕CD腸道炎癥。

艾灸；克羅恩病；大鼠；結腸組織損傷積分；免疫球蛋白

克羅恩病（CD）是一種以腹痛、腹瀉、腹部結塊為主要特征的炎癥性腸病，病變后期CD患者常因腸道慢性炎癥的反復發作和組織損傷修復，出現腸纖維化，最終導致腸腔狹窄和腸壁僵硬等病理改變。目前認為，免疫反應是CD發生發展的重要機制之一，西醫主要采用5-氨基水楊酸、糖皮質激素、硫唑嘌呤等免疫調節劑治療，但不良反應較大且療效欠佳[1]。本研究探索運用艾灸治療實驗性CD大鼠，觀察不同灸量艾灸對大鼠結腸組織損傷積分和血清免疫球蛋白IgG、IgA、IgM的影響。

1 實驗動物與方法

1.1 實驗動物雄性清潔級SD大鼠45只，體質量（180±20）g。安徽醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與造模將45只大鼠隨機分成正常組、模型組、艾灸A組、艾灸B和艾灸C組共5組，每組9只。其中對模型組、艾灸組36只大鼠進行實驗CD造模，模型制備參照目前國際公認的Morris[2]法，采取三硝基苯磺酸（TNBS）溶液灌腸制備。

大鼠于造模前24 h禁食但不禁水。1）TNBS灌腸液制備：先將無水乙醇加雙蒸水，配制成50%的乙醇，再將50%乙醇與TNBS以1︰2比例混合配制成TNBS灌腸液。2）動物麻醉：使用2%戊巴比妥鈉按照20 mg/kg進行動物腹腔注射麻醉。3）灌腸：造模組大鼠以TNBS溶液按100 mg/kg灌腸。大鼠體位為肛門朝上，頭朝下，以灌胃針插入肛門約6～8 cm，注入灌腸液后拔出灌胃針，保持肛門朝上體位約5 min，防止灌腸液溢出。7 d后重復灌腸1次，總計灌腸4次。4）模型鑒定：為確定CD大鼠模型制備成功，每組于造模結束后隨機抽取1只大鼠進行結腸組織形態學觀察。

1.2.2 治療方法造模結束后進行治療。

艾灸A組（n=8）：取天樞（雙），穴位定位根據《實驗針灸學》[3]確定，在天樞穴行艾條溫和灸，用小艾條點燃后距離穴位上方1～2 cm施灸，每日1次，雙側天樞各灸5 min，共治療14 d。艾灸B組（n=8）：方法同艾灸A組，每次艾灸時間為15 min，共治療14 d。艾灸C組（n=8）：方法同艾灸A組，每次艾灸時間為25 min，共治療14 d。正常組（n=8）：不進行任何處理，只做與治療組相同的固定。模型組（n= 8）：不進行任何處理，只做與治療組相同的固定。

1.3 實驗檢測

1.3.1 大鼠結腸組織損傷積分治療結束后，經腹主動脈取血后處死動物，約距肛門6～8 cm處截取2～3 cm長結腸一段，用生理鹽水反復沖洗后，置于10%福爾馬林溶液中固定。

采用蘇木精-伊紅染色（HE）法染色后進行結腸組織病理學觀察。取固定后的結腸組織，按照常規脫水、透明、石蠟包埋、切片，然后將厚度約4 μm的石蠟切片貼片后置58℃烘箱烤片24 h，常規脫蠟至水，分別于二甲苯Ⅰ、Ⅱ中浸泡各20 min，后于無水乙醇、95%乙醇Ⅰ、Ⅱ中各10 min，流水沖洗1 min后蘇木精襯染10 min，再水洗1 min，最后伊紅著色10 s，常規脫水并樹脂封片后，顯微鏡下觀察結腸組織病理變化。統計結腸組織損傷積分，觀察結腸炎癥、黏膜潰瘍、腺體排列、黏膜下層充血水腫及纖維增生5方面指標，每個指標以“+”號代表結腸病損程度，計算積分時每1個“+”號計1分。

1.3.2 大鼠血清IgG、IgA、IgM水平檢測大鼠麻醉后腹部朝上固定，以手術剪沿腹中線依次剪開皮膚、皮下組織、腹膜，暴露腹腔，在腹腔正中找到腹主動脈，右手持穿刺針，針尖斜面朝下，入針角度約25～30°，朝向心端方向刺入，深度以5 mm左右為宜,抽吸血液8～10 mL入試管內，將試管置高速離心機內以2 000 r/min離心15 min，取血清于-20℃冰箱保存后ELISA法檢測大鼠血清IgG、IgA、IgM含量。

1.4 統計學分析采用SPSS 18.0統計軟件進行數據處理。計量資料用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 各組大鼠結腸組織學損傷積分見表1。

表1顯示，與正常組比較，各組結腸組織學損傷積分差異均有統計學意義（P＜0.01），治療組中，除艾灸A組外，其余兩組與模型組比較差異均有統計學意義（P＜0.01），但艾灸B組與艾灸C組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 各組大鼠血清IgG、IgA、IgM水平見表2、表3、表4。

表1 各組大鼠結腸組織學損傷積分比較（±s）分

表1 各組大鼠結腸組織學損傷積分比較（±s）分

注：與模型組比較，*P＜0.01；與正常組比較，＃P＜0.01；與艾灸B組比較，△P＞0.05。

組別n損傷積分正常組80.750 0±0.366 0*模型組89.125 0±0.515 4＃艾灸A組88.000 0±0.567 0＃艾灸B組84.250 0±0.250 0*＃艾灸C組84.125 0±0.226 6*＃△

表2 各組大鼠外周血IgA水平比較（±s）g/L

表2 各組大鼠外周血IgA水平比較（±s）g/L

注：與模型組比較，*P＜0.01；與正常組比較，＃P＜0.01；與艾灸A組比較，△P＜0.01；與艾灸B組比較，□P＞0.05。

組別nIgA正常組80.361 3±0.184 0*模型組81.998 8±0.605 2＃艾灸A組81.313 8±0.290 3*＃艾灸B組80.630 0±0.221 8*△艾灸C組80.672 5±0.317 5*△□

表2顯示，模型組大鼠外周血IgA水平明顯上升，治療組治療后IgA水平有明顯下降，但艾灸A組與正常組比較差異亦有統計學意義（P＜0.01）。艾灸B組與艾灸C組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠外周血IgG水平比較（±s）g/L

表3 各組大鼠外周血IgG水平比較（±s）g/L

注：與模型組比較，*P＜0.01；與正常組比較，＃P＜0.01；與艾灸A組比較，△P＜0.01；與艾灸B組比較，□P＞0.05。

組別nIgG正常組80.640 0±0.294 0*模型組85.363 8±0.835 6＃艾灸A組84.388 8±0.833 7*＃艾灸B組81.188 8±0.452 9*△艾灸C組81.423 8±0.539 7*＃△□

表3顯示，治療后各組大鼠外周血IgG水平與模型組比較差異均有統計學意義（P＜0.01），但除艾灸A組外，其余兩組與正常組比較差異亦有統計學意義（P＜0.01）。治療組中，艾灸A組與艾灸B組、艾灸C組比較，差異有統計學意義（P＜0.01），艾灸B組與艾灸C組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

表4 各組大鼠外周血IgM水平比較（±s）g/L

表4 各組大鼠外周血IgM水平比較（±s）g/L

注：與模型組比較，*P＜0.01；與正常組比較，＃P＜0.01；與艾灸A組比較，△P＜0.01；與艾灸B組比較，□P＞0.05。

組別nIgM正常組80.220 0±0.094 1*模型組81.227 5±0.207 8＃艾灸A組80.695 0±0.125 1*＃艾灸B組80.245 0±0.058 3*△艾灸C組80.263 8±0.048 7*△□

表4顯示，各組大鼠外周血IgM水平與模型組比較差異均有統計學意義（P＜0.01），但艾灸A組血IgM水平雖有下降，與正常組比較差異有統計學意義（P＜0.01），與艾灸B組和艾灸C組比較差異亦有統計學意義（P＜0.01)；艾灸B組與艾灸C組血IgM水平下降差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

克羅恩病（CD），又稱局限性腸炎、節段性腸炎和肉芽腫性腸炎，是一種病因尚未完全明了的以末端回腸與鄰近結腸發病為多見的炎癥性腸病。臨床主要表現為慢性起病、反復發作的腹痛、腹瀉、腹部腫塊、腸瘺和肛門病變，可伴有發熱、貧血、體質量下降等全身癥狀及關節、皮膚、眼、口腔黏膜等腸外損害。重癥患者常因腸道慢性炎癥的反復發作和組織的損傷修復，導致腸纖維化，從而出現腸腔狹窄和腸壁僵硬等病理改變，使病情遷延難愈，預后不良。近年來，國內外流行病學研究顯示在經濟發達的地區及城市其發病率呈上升趨勢[4-6]。盡管CD病因與發病機制尚不明確，目前一致認為CD的發病與環境、免疫及遺傳等因素密切相關，上述因素引發機體及腸道組織的過激免疫反應是CD發生發展的關鍵。臨床研究顯示，CD患者腸黏膜上皮屏障完整性受損，緊密連接被破壞，上皮細胞凋亡或壞死，腸上皮通透性增加，從而腸腔抗原反復刺激并大量攝入使腸免疫系統錯誤識別，引起免疫級聯反應，從而導致CD慢性腸道炎癥[7]。CD作為炎癥性腸病的一種，免疫反應異常是其發病的重要機制[8-9]。

艾灸具有溫散寒邪、溫通經絡、活血逐瘀、消腫散結的功效。近年來，艾灸對免疫系統、神經-內分泌-免疫網絡系統、消化系統以及機體代謝等方面的調節作用研究越來越收到廣泛關注，尤其是艾灸對免疫功能的影響正成為目前研究的熱點。研究表明，灸療對免疫功能有雙向調整作用，對存在免疫障礙者可提高患者的特異性和非特異性免疫功能[10-11]，使血清中免疫球蛋白明顯增高，特異性抗體滴度增加，血清總補體含量升高。而對免疫反應過激者，艾灸具有抗炎與免疫調節作用，其機制可能是通過抑制炎癥因子的釋放，糾正炎癥時自由基代謝的紊亂，改善去甲腎上腺素、5-羥色胺等神經遞質的失衡，穩定機體內環境等多方面作用來實現的[12]，灸療要產生一定療效，首先必須有一定的灸量積累，當灸量積累到一定程度時，易產生灸感,獲得一定的灸感后產生灸效。所以，灸量是灸療起效的關鍵因素。但并非灸量越大，灸效越好，灸量與灸效之間不呈完全的線性關系。影響灸量的因素主要包括灸火勢大小、施灸時間、灸治溫度和灸治頻度等[13]。張京英等[14]觀察不同灸法、灸量對家兔全血組胺含量的影響，實驗表明灸后90 min，各艾灸組家兔全血中組胺含量有很大差異。艾條強刺激時,皮膚溫度達到55℃，持續5 min，全血組胺明顯升高；艾炷強刺激時,皮膚溫度達190℃，持續90 s左右，全血組胺含量并無升高,與灸前相近；弱刺激中,艾條灸時皮膚溫度保持在40℃左右,對家兔全血組胺無影響,小艾炷灸時皮膚溫度達150℃約50 s左右，全血組胺反而明顯下降。說明灸效與不同灸法、刺激量的大小有密切關系。過強（大艾炷）或過弱（艾條弱刺激）的艾火刺激均不能使血中組胺發生變化，而較強的（艾條強刺激）艾火刺激可使家兔全血中組胺明顯升高，中強的（小艾炷）艾火刺激可降低全血組胺的含量。李守棟[15]研究灸法不同刺激量對雷公藤甲素不良反應的影響,結果提示不同刺激量艾灸拮抗雷公藤甲素毒性反應的作用不同，一個中等程度的刺激更較輕刺激或強刺激有利于機體的臟器抵抗藥物的不良反應。張英等[16]采用不同灸治時程治療陽虛小鼠模型，結果顯示：不同灸治時程對陽虛小鼠模型的T淋巴細胞酯酶陽性率、白細胞介素2的影響存在差異,灸15 min可顯著提高陽虛小鼠T淋巴細胞酯酶陽性率（P＜0.01），灸5、25 min則無顯著作用；灸15、25 min均可顯著提高陽虛小鼠白細胞介素2活性，兩者之間無統計學差異,而灸5 min無顯著作用。

本研究選取灸治時間這一重要灸量因素治療CD顯示，CD模型大鼠外周血IgA、IgG、IgM水平明顯升高，不同灸量艾灸后，盡管各組大鼠血清IgA、IgG、IgM水平均有下降的趨勢，但艾灸B組和艾灸C組大鼠血清IgA、IgG、IgM水平下降最為明顯，且腸道炎性損傷最小，具有顯著的優勢，艾灸B組和艾灸C組之間無統計學差異，說明灸效并非與灸量完全正相關，合適的灸量能顯著降低血清IgA、IgG、IgM水平，調節免疫水平，從而抑制CD過激的免疫反應。

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Influence of different quantity of moxibustion on colon damage and serum IgG,IgA,IgM level in rats with crohn’s disease

WANG Jing,XIA Xiao-hong,YE Min,JANG Li,WU Si-dan
（Anhui College of TCM,Hefei 230038,China）

[Objective]To explore the effects and mechanism in treating Crohn’s Disease(CD)with different quantity of moxibustion(moxi).[Methods]Forty-five rats with CD were divided into 5 groups:normal group,model group,moxi A group,moxi B group and moxi C group.At the fourteenth days after disposing,their integral score of the colon damage and the serum IgG,IgA,IgM level were observed.[Results]The integral score of the intestinal injury and the serum IgG,IgA and IgM level in model group was higher than that in the rest of group(P＜0.01),moxi can lower the integral score of colon damage,the serum IgG,IgA and IgM level and was benefited for the colon inflammatory response.But the effect of moxi for 5 min was not significant,the effect of moxi for 15 min was as significant as the effect of moxi for 25 min(P＞0.01).[Conclusion]Proper moxibustion quantity can significantly lower the integral score of colon damage and the serum IgG,IgA and IgM level,improve the immune system,alleviate the colon inflammatory changes in rats with CD.

moxibution;Crohn’s Disease;rats;the integral score of intestinal injury;immune globulin

R245.81

A

1673-9043（2014）01-0022-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2014.01.08

2013-10-16）

安徽省科技計劃2012年度重點項目（11070403060）。作者簡介：王莖（1964-），男，醫學博士，教授，碩士生導師，主要從事針灸免疫研究。