槲皮素對高糖誘導的RPE細胞凋亡的保護作用及機制

張靜琳* 易魁先 陳 韻 武哲明 吳斌斌 高汝龍

（愛爾眼科醫院集團廣州愛爾眼科醫院，廣東 廣州510080）

槲皮素對高糖誘導的RPE細胞凋亡的保護作用及機制

張靜琳* 易魁先 陳 韻 武哲明 吳斌斌 高汝龍

（愛爾眼科醫院集團廣州愛爾眼科醫院，廣東 廣州510080）

目的研究槲皮素對高糖誘導的RPE細胞凋亡的保護作用及其作用機制。方法將A-RPE19細胞系的細胞分別培養于普通培養基和高糖培養基中，其中高糖培養基內分別加入0、50、100、150 mmol/L的槲皮素，培養24 h以后用TUNEL檢測各組細胞的凋亡，并根據該結果選取槲皮素的最佳作用濃度，進行caspase3的免疫熒光染色，線粒體酶復合物的活性測定。結果高糖培養的RPE細胞的凋亡指數（TUNEL陽性細胞/總細胞數）明顯高于對照組，槲皮素可以明顯抑制高糖誘導的RPE細胞的凋亡，其中以100 mmol/L的濃度作用效果最強，與高糖培養組相比，其差異有明顯的統計學意義（P＜0.05）。高糖組的caspase3的免疫熒光染色明顯強于對照組和高糖+100 mmol/L槲皮素組。線粒體復合酶Ⅱ的活性各組之間并無統計學差異。高糖組的線粒體復合酶Ⅰ和Ⅳ的活性均明顯低于對照組和高糖+100 mmol/L槲皮素組（P＜0.05）。結論槲皮素可以抑制由高糖誘導的RPE細胞的凋亡，其作用是通過抑制caspase3的激活和線粒體保護實現的。

槲皮素；RPE細胞線粒體氧化應激

糖尿?。―iabetes Mellitus，DM）已成為21世紀世界范圍內的一種嚴重威脅人類健康的慢性非傳染性疾病，是當前世界各國共同面對的公共健康問題。氧化應激與糖尿病及其并發癥的發生、發展密切相關。線粒體不僅是細胞能量轉化的中心，也是細胞內自由基的主要來源[1]。班廷獎得主Brownlee教授提出糖尿病并發癥發病的統一機制學說[2]：發生糖尿病并發癥的經典途徑——多元醇途徑、糖基化終末產物（AGE）途徑、蛋白激酶C（PKC）途徑和氨基己糖途徑，均是在高糖環境下，由線粒體呼吸鏈中氧自由基生成過多導致的結果。槲皮素是黃酮類中分布最廣、抗氧化能力最強的一種天然藥物，其化學名為3，3′，4′，5，7-五羥基黃酮（Pentahydroxyflavone），化學分子式為C15H10O7·xH2O，相對分子質量為302.24。目前，槲皮素對糖尿病作用的體內研究大多集中在心、肝和腎等器官方面，它能降低糖尿病動物的血糖，保護肝臟胰島β細胞死亡[3-5]，減少腎功能損害[6]，提高心肌收縮功能等[7，8]。對糖尿病眼病，特別是DR的研究甚少。有研究稱槲皮素可以顯著地抑制由VO（acac）-2引起的線粒體毒性和細胞毒性[9]。因此，我們推斷槲皮素可能對高糖誘導的人視網膜色素上皮細胞的凋亡有保護作用，而且其保護作用是通過線粒體的保護而實現的。為此，我們設計了此課題，為其臨床應用提供可靠的實驗基礎和理論依據，為中草藥的開發利用提供重要的研究線索，還可能為糖尿病視網膜病變的早期防治提供新的藥物靶點和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

將人RPE細胞APRE-19細胞株（購于美國模式培養物集存庫）復蘇后，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養液，置于37.5 ℃，5% CO2的孵育箱中培養。細胞生長融合后用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，選取第5～15代細胞用于實驗。

1.2 實驗分組

實驗分組：分為：①對照組，培養基葡萄糖濃度為5.6 mmol/L，培養基中不加入任何藥物；②高糖組，培養基葡萄糖濃度30 mmol/L；③高糖+不同濃度梯度槲皮素組，槲皮素的濃度分別為50、100、 150 mmol/L。各組細胞培養48 h以后進行各項檢測。

1.3 試劑配制

槲皮素（美國Sigma公司）用二甲基亞楓（美國Sigma公司）溶解成10 mg/mL的溶液，抽濾滅菌。再用培養基配成相應的濃度。

1.4 TUNEL計數測量細胞凋亡

細胞用4%多聚甲醛固定，按照TUNEL試劑盒（美國Roche公司）指示，進行TUNEL檢測，在每張片子上隨機選取10個視野，計算每個視野內TUNEL陽性的細胞數和總細胞數，凋亡指數=TUNEL陽性細胞數/總細胞數。根據TUNEL結果選擇槲皮素的最佳作用濃度。

1.5 免疫熒光染色

細胞用4%多聚甲醛固定30 min后，用甲醛冰醋酸（1∶1）混合液固定10 min后，用1∶200 Caspase3抗體（美國Cell Signaling公司，Cleaved Caspase-3抗體，#9664）孵育，4 ℃過夜，然后用anti-Rabbit的二抗（美國Molecular Probes公司的Alexa Fluor? 488 Donkey Anti-Rabbit IgG（H+L）Antibody）1∶400孵育1 h，進行caspase3的免疫組織熒光染色。

1.6 線粒體酶復合物活性測定。

將細胞按線粒體提取試劑盒（美國Pierce公司）說明書提取線粒體溶液，將線粒體溶液以BCA法進行蛋白定量[10]，根據定量結果稀釋為10 mg/mL，分裝保存于-70 ℃。

線粒體于-20 ℃/20 ℃反復凍融3次以破壞線粒體膜，測定溫度為30 ℃，反應體積為1 mL。分別測定酶復合體Ⅰ酶復合體Ⅱ和酶復合體Ⅳ在特定波長處的光吸收值，酶樣本活性（RI）=（△A/min×TV× 106）/（ε×l×SV）。其中，△A/min為每分鐘吸光度的變化，TV為反應系統總體積，SV為樣本體積，ε為被測物的摩爾消光系數，l為光徑，酶活力以μmol/min/mg蛋白表示。

2 結 果

2.1 TUNEL結果

對照組中，TUNEL指數為0.1%；高糖組中，TUNEL指數為38.2%；與對照組相比差異有明顯的統計學意義（P=0.000＜0.05）。

高糖+50 mmol/L槲皮素組，TUNEL指數為16.7%；高糖+100 mmol/L槲皮素組，TUNEL指數為2.1%；高糖+150 mmol/L槲皮素組，TUNEL指數為15.7%。高糖+槲皮素組各個不同濃度均有保護高糖誘導的RPE細胞凋亡的作用，其中以100 mmol/L組的保護作用最強。與高糖組相比，具有明顯的保護作用（P=0.000＜0.05）。

2.2 免疫熒光染色

高糖組caspase3的免疫熒光染色明顯強于高糖+100 mmol/L槲皮素組和對照組。見圖1。

圖1 免疫熒光染色圖

2.3 線粒體復合酶活性測定

線粒體復合酶Ⅱ各組之間并無統計學差異，而線粒體復合酶Ⅰ和線粒體復合酶Ⅳ中，高糖組的酶活性均明顯低于對照組（P＜0.05），高糖組明顯低于高糖+100 mmol/L槲皮素組，而對照組與高糖+100 mmol/L槲皮素組相比沒有明顯的統計學差異。

高糖培養下的RPE細胞的線粒體復合酶Ⅰ和Ⅳ活性明顯降低，反映了線粒體功能的受損，而加入100 mmol/L的槲皮素可以使線粒體復合酶Ⅰ和Ⅳ活性顯著提高，說明槲皮素對高糖培養的RPE細胞的凋亡是通過改善線粒體的功能而實現的，見表1。

表1 不同糖濃度下線粒體復合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ的活性比較

3 討 論

糖尿病視網膜內存在由氧化應激導致的線粒體的損害。已有研究模擬并證實了一條糖尿病早期視網膜病變發生發展的途徑：高糖血癥及其糖代謝異常引發視網膜組織氧化應激，氧化應激激活下游信號通路P38 MAPK，P38 MAPK通路將氧化應激死亡信號從細胞外傳遞到細胞內，誘導Caspases級聯反應，導致神經節細胞凋亡[11]；同時誘導視網膜VEGF表達異常，VEGF和基質細胞衍生因子（stromal cell-derived factor-1 SDF-1）的“正反饋”，促進人視網膜微血管內皮細胞的增殖和遷移，導致血-視網膜屏障（Blood-retinal Barrier，BRB）破壞[12]。而對DR患者玻璃體進行測定，也發現了氧化應激標志物水平顯著升高[13]。高糖誘導牛視網膜內皮細胞后以及對糖尿病鼠視網膜組織進行檢測，發現ROS顯著增高，且增高的R0S主要來源于線粒體，因為電子傳遞鏈復合體Ⅱ抑制劑可完全抑制高糖對視網膜內皮細胞的這種誘導作用，而NADPH氧化酶及一氧化氮合酶（NOS）抑制劑的作用微弱[14]。諸多的文獻的資料[15-20]表明，在糖尿病視網膜血管結構中氧自由基的增加可導致線粒體出現損害現象如：NK-κB被激活，Bax轉移至線粒體內。這些現象導致了細胞色素C從線粒體釋放至細胞質，進而可激活caspase-9，隨后激活caspase-3，最終導致視網膜細胞的死亡。

在本研究中，槲皮素組RPE細胞的凋亡指數顯著低于高糖培養的RPE細胞，高糖培養的RPE細胞的Caspase3染色明顯強于對照組和槲皮素組，可見槲皮素是通過抑制caspase3的激活從而對高糖誘導的RPE凋亡起保護作用。此外，因糖尿病而增加的過氧化硝酸鹽亦加劇線粒體的功能不良。功能不良的線粒體可產生更多的氧自由基，進而導致氧化損傷的惡性循環。在我們的研究中，高糖培養下的RPE細胞的線粒體復合酶Ⅰ和Ⅳ活性明顯降低，反映了線粒體功能的受損，而100 mmol/L的槲皮素可以使線粒體復合酶Ⅰ和Ⅳ活性顯著提高，說明槲皮素對高糖培養的RPE細胞的凋亡是通過改善線粒體的功能而實現的。因此，如果我們在DR發展的早期就進行線粒體的保護，有望阻止DR的進展，本實驗結果為DR的早期預防和治療提供了新的思路和靶點。

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B

1671-8194（2014）11-0064-03

廣州市醫藥衛生科技項目（201102A213221）

*通訊作者：E-mail： zhjinglin@126.com