LAMA4基因對喉癌細胞增殖和侵襲的調控機制

鄔振華 李群 龔朝暉 沈志森

LAMA4基因對喉癌細胞增殖和侵襲的調控機制

鄔振華 李群 龔朝暉 沈志森

目的 構建層粘連蛋白α4亞基（LAMA4）的過表達和干擾序列重組慢病毒，觀察其對Hep-2喉癌細胞株增值和侵襲的調控機制。方法 全基因合成LAMA4序列并篩選有效的LAMA4基因干擾序列，重組入帶有綠色熒光蛋白慢病毒載體。采用慢病毒感染喉癌細胞株Hep-2后，通過Western blot檢測過表達和干擾效率。MTT法檢測LAMA4基因表達變化時Hep-2細胞株增殖能力的變化。Transwell實驗檢測喉癌細胞株感染前后侵襲能力的變化。利用Western blot和Real-time PCR檢測基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)與膜型基質金屬蛋白酶(MT1-MMP)的基因表達量變化情況。結果 （1）攜帶LAMA4基因片段和小干擾片段的重組慢病毒成功構建，包裝慢病毒后濃縮病毒懸液滴度達到5×105TU/μl。（2）基因沉默組LAMA4蛋白相對表達量明顯低于對照組，過表達組相對表達量明顯高于對照組，差異均有統計學意義（均P＜0．05）。（3）LAMA4干擾慢病毒感染Hep-2喉癌細胞株后，細胞株增殖無明顯變化。（4）Transwell小室檢測發現，基因沉默組及過表達組Transwell細胞數與對照組的差異均有統計學意義（均P＜0．05）。（5）與對照組比較，基因沉默組及過表達組MMP-2及MT1-MMP基因與蛋白表達均發生明顯變化，差異均有統計學意義（均P＜0．05）。結論 LAMA4基因可能是通過MMP-2和MT1-MMP基因相關通路調節喉癌細胞的侵襲能力，LAMA4可以作為治療喉癌轉移的潛在靶點。

基因 喉癌 慢病毒 侵襲能力 增殖

喉癌是耳鼻喉-頭頸外科常見的惡性腫瘤之一，發 生率約占全身惡性腫瘤的5%，在我國的發病率呈上升趨勢[1]。喉癌患者5年內死亡的主要原因之一為腫瘤的侵潤和轉移，而腫瘤的侵襲和轉移機制已成為目前全球研究的熱點。喉癌作為頭頸外科的多發病，其發生、發展涉及多中心、多環節、多通路，分子生物學機制尚未明確。隨著分子生物學研究技術的發展，喉癌侵襲和轉移的分子機制研究逐漸受到重視[2-3]。層粘連蛋白（Laminin，LN）是構成基底膜的重要成分之一，有研究證實，LN在高分化喉癌組織中表達水平顯著低于低分化及中分化喉癌，并且和淋巴結轉移能力相關[4]。LNα4亞基（Laminin A1-pha4，LAMA4）是LN的重要功能型亞基，是細胞外基質中與腫瘤侵襲和轉移密切相關的一種功能性基因。腫瘤的侵襲和轉移包括細胞黏附、細胞外基質降解、細胞移動等步驟，LAMA4基因被證明在此過程中發揮了重要作用[5]。本研究擬通過構建重組慢病毒使LAMA4基因表達量發生變化，在過表達和沉默LAMA4基因后，觀察喉癌細胞增殖和侵襲能力的變化，以初步探討LAMA4基因對喉癌Hep-2細胞株增殖和侵襲能力的影響及作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料 Hep-2喉癌細胞株購于上海中科院細胞庫。DMEM培養基、FBS、0.25%胰蛋白酶軍購自Invitrogen公司；多克隆抗體購于Creative Biomart公司。βactin單克隆抗體購于美國Santa Cruz公司，二抗購于北京中杉公司。慢病毒由寧波大學生化實驗室包裝。細胞LAMA4基因的Genebank編號為NM 001105208。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 Hep-2喉癌細胞株培養在含10%FBS的DMEM培養基中，置于5%CO237℃恒溫培養箱中。

1.2.2 重組慢病毒感染Hep-2喉癌細胞株 用攜帶LAMA4全基因序列和LAMA4的小干擾RNA（sma11 interfering RNA，siRNA）序列的慢病毒感染Hep-2細胞株。將5×105個Hep-2細胞接種于24孔板，融合度達到50%～60%時分別用LAMA基因和siRNA的慢病毒和空載體病毒感染復數為50的病毒感染Hep-2細胞，72h后用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白（green f1uorescent protein，GFP）表達陽性的細胞，計算重組慢病毒感染效率（重組慢病毒感染效率=GFP陽性細胞數/該視野下的總細胞數）。

1.2.3 基質金屬蛋白酶-2（matrix meta11oproteinases-2，MMP-2）、膜型基質金屬蛋白酶（membranetype-1 MMP，MT1-MMP）及LAMA4蛋白表達量檢測 （1）分別將基因沉默組、過表達組和空載體病毒對照組細胞收集起來，PBS洗滌2次，去上清液，迅速加入100μ1細胞裂解液，用細胞刮刀刮下細胞后超聲裂解，4℃離心20min。取上清液BCA法測定蛋白濃度后，按比例加入5×SDSPAGE上樣緩沖液，沸水浴10min后保存待用。配制5%濃縮膠及10%分離膠后，取20μg蛋白上樣進行SDSPAGE電泳。80V電壓于濃縮膠中電泳，待溴酚藍達到濃縮膠和分離膠分界時，改用120V電壓繼續電泳，至溴酚藍至凝膠底部時終止電泳。電泳后4℃下12V轉膜過夜，室溫封閉60min。將蛋白條帶按照分子量大小裁剪后，放入LAMA4和β-actin的相應一抗（兔多克隆抗體）中，4℃過夜。次日，先將孵育一抗的PVDF膜取出，用緩沖液洗滌后，加入相應的二抗（山羊抗兔）進行孵育，1h后將條帶取出，進行曝光處理，同時將膜上相應的內參條帶置入內參抗體中進行孵育過夜，次日孵育二抗后曝光處理。以結果條帶與內參β-肌動蛋白（βactin）吸光度值的比值作為目的條帶測量值。（2）依照前一步驟方法對3組細胞的蛋白分別進行提取,測定蛋白濃度后待用。將各組細胞取20μg蛋白上樣進行SDSPAGE電泳，轉膜。剪裁相應分子量大小的PVDF膜孵育MMP-2、MT1-MMP的兔多克隆抗體，4℃過夜。次日孵育山羊抗兔二抗后，進行曝光處理。同樣與內參比較后進行灰度分析得出測量值。

1.2.4 Hep-2細胞侵襲能力測定 將Transwe11小室（BD公司）上下室之間用孔徑為8 μm的硝酸酯膜分開，膜上鋪Matrige1膠，50μg/室。下室用10%FBS作為趨化因子，上室分別加入密度為1×106個/m1的Hep-2細胞400μ1。孵育24h，取出拭去膜上層剩余細胞，用4%多聚甲醛固定，蘇木素染色，光學顯微鏡下觀察。每張膜隨機取5個視野，實驗重復3次，取均值作為最終結果。

1.2.5 細胞生長檢測 采用MTT法。選對數生長期的各組細胞，胰蛋白酶消化，以5 000個細胞/孔接種于96孔板中。連續培養3d，每天選擇3個孔，單孔加入20μ1（5mg/m1）MTT，37℃、5%CO2培養4h；每孔加入150μ1 DMSO，室溫下搖床震蕩10min，使紫色結晶充分溶解，490nm測定吸光值。

1.2.6 MMP-2和MT1-MMP基因表達量檢測 分別提取各組細胞的總RNA，逆轉錄后，運用Rea1-time PCR方法檢測。Rea1-time PCR反應總體系為20μ1，其中上下游引物各1 μ1，cDNA模板2μ1，SYBR Premix Ex TaqⅡ10μ1，雙蒸水補足體系至20μ1。反應條件為95℃預變性3min；94℃變性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，共40個循環。PCR反應結束后采用比較閾值法測定目的基因的相對表達水平，可以直接得到目的基因相對于內參基因（GAPDH）的定量。目的基因的表達水平=2-△Ct，其中△Ct=（目的基因Ct-參照基因Ct）。PCR引物序列見表1。

1.3 統計學處理 采用SPSS18.0統計軟件，所得數據以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。

表1 PCR引物序列

2 結果

2.1 慢病毒感染效率 攜帶LAMA4基因片段和小干擾片段的重組慢病毒成功構建，包裝慢病毒后，濃縮病毒懸液滴度達到5×105TU/μ1。重組慢病毒感染Hep-2細胞72h后，倒置熒光顯微鏡下觀察各孔中GFP的表達量，攜帶LAMA4全基因序列和siRNA序列的慢病毒及空載體病毒感染組中，Hep-2細胞GFP表達均成陽性，且陽性率達90%，詳見圖1。

圖1 光鏡下重組慢病毒感染Hep-2細胞株的情況（×200）

2.2 過表達和基因沉默后喉癌細胞中LAMA4蛋白水平的變化 對照組LAMA4蛋白相對表達量為0.56± 0.15，基因沉默組為0.39±0.16，過表達組為0.87±0.20，其電泳圖見圖2。基因沉默組相對表達量明顯低于對照組，過表達組相對表達量明顯高于對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

圖2 LAMA4蛋白相對表達量的變化

2.3 LAMA4基因表達變化對Hep-2細胞侵襲能力的影響 Transwe11小室檢測發現，對照組Transwe11細胞數為（26±3.61）個，基因沉默組及過表達組分別為（45± 5.80）、（14±3.26）個，基因沉默組及過表達組與對照組的差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

2.4 LAMA4基因表達變化對喉癌細胞株生長的影響見表2。

表2 第1～3天喉癌細胞株生長情況的比較（吸光值）

由表2可見，第1～3天各組喉癌細胞生長情況并無明顯區別，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

2.5Hep-2細胞中MMP-2及MT1-MMP基因及蛋白表達變化的比較 見表3。

表3 Hep-2細胞中MMP-2及MT1-MMP基因表達變化的比較

由表3可見，與對照組比較，基因沉默組及過表達組MMP-2及MT1-MMP基因與蛋白表達均發生明顯變化，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

3 討論

在腫瘤組織中，基底膜和細胞外基質是腫瘤侵襲和轉移過程中的第一道屏障，在腫瘤的發生、發展過程中起著重要的生物學作用。研究表明，基底膜斷續或消失的實驗組，頸淋巴結轉移率遠高于基底膜完整組。而腫瘤轉移則需先突破基底膜的限制，而后侵襲周圍組織，進而向遠處轉移。而完整的基底膜則具有限制腫瘤轉移的作用。Laminin-8是基底膜中主要的非膠原成分，參與細胞的生長、運動、分化等生物過程，介導腫瘤細胞和基底膜的黏附；其表達缺失程度提示著基底膜的破壞程度，預示腫瘤的穩定性同時也受到了破壞[6]。而LAMA4是Laminin-8中重要的功能型亞基，其主要參與了腫瘤轉移過程中細胞間質的降解、細胞微環境改變等步驟[3]。有研究表明，LAMA4可能具有抑制腫瘤轉移的作用[5,7]。

本研究成功構建了攜帶LAMA4基因片段和小干擾片段的重組慢病毒，包裝慢病毒后濃縮病毒懸液滴度達到5×105TU/μ1。Transwe11侵襲小室實驗證明，在LAMA4基因過表達時，穿過小室的細胞數相比對照組減少，提示喉癌細胞株Hep-2的侵襲能力減弱。而將LAMA4基因沉默后，Hep-2細胞的侵襲能力顯著增強。由此可推斷，LAMA4在喉癌細胞侵襲轉移的過程中可能發揮著重要的作用。LAMA4的表達量與喉癌細胞的侵襲和轉移能力呈負相關。細胞侵襲能力增強會直接導致喉癌的局部浸潤、頸淋巴結轉移和遠處轉移，因此LAMA4在喉癌組織中的表達量可以作為預測喉癌侵襲和轉移的重要因素之一。LAMA4影響喉癌侵襲和轉移的分子機制目前還不明確，而增加LAMA4基因的表達很可能對喉癌的侵襲和轉移產生抑制作用。因此，LAMA4基因可以作為喉癌藥物治療的潛在靶點。

在腫瘤侵襲和轉移的諸多研究中MMPs具有重要的意義。MMPs是一組鋅離子依賴性蛋白，其中MMP-2和MT1-MMP作為腫瘤細胞的侵襲標志物,與基底膜的降解有著重要的關系[7-8]，在腫瘤的發生、發展中發揮著重要的作用[9]。為了進一步探尋LAMA4的作用機制，采用Western B1ot檢測發現，LAMA4表達量變化時MMPs家族蛋白表達隨之發生變化；當LAMA4基因被沉默后，MMP-2和MT1-MMP的表達升高，這進一步證實了當LAMA4表達量減少時，喉癌細胞的侵襲相關分子的表達量升高，侵襲能力增強；而LAMA4過表達時，MMP-2和MT1-MMP的表達量隨之下降，喉癌細胞的侵襲能力進而降低。因此可以推斷，作為基底膜中的重要組成部分，LAMA4表達量的變化則與喉癌細胞侵襲和轉移的能力有著密切的聯系，LAMA4可能是通過MMPs蛋白家族發揮作用。

[1]Ji X,Jingli J V,Liu Q,et al．Construction of the superantigen SEAtransfected laryngocarcinoma cells[J]．Lin chuang er bi yan hou tou jing wai ke za zhi=Journal of clinical otorhinolaryngology, head,and neck surgery,2013,27(7):376-378．

[2]陳英武,張靖華,平金良,等．E-cadherin,FAK在聲門上型喉癌組織中的表達及其與頸淋巴結隱性轉移的相關性[J]．浙江醫學,2011,33(10): 1439-1440．

[3]Aumailley M．The laminin family[J]．Cell adhesion&migration,2013, 7(1):48-55．

[4] 夏曉麗,齊恒,劉清明,表皮鈣黏蛋白和層粘連蛋白在喉癌及下咽鱗狀細胞癌中表達及意義[J]．中華實用診斷與治療雜志，2012，26(7):680-681．

[5]Yang X,Li W,Guo L．The study on the anti-tumor function of lysozyme in the regional lymph nodes of laryngocarcinoma patients[J]．Lin chuang er bi yan hou ke za zhi=Journal of clinical otorhinolaryngology,1998,12(2):51-53．

[6]Badran E F,Battah H A,Akl K F,et al．Detection of novel LAMA3 mutation in Herlitz junctional epidermolysis bullosa in a Jordanian family[J]．The Australasian Journal of Dermatology,2013,54(3): 218-221．

[7]Secco M,Bueno C Jr,Vieira N M,et al．Systemic delivery of human mesenchymal stromal cells combined with IGF-1 enhances muscle functional recovery in LAMA2 dy/2j dystrophic mice[J]．Stem cell reviews,2013,9(1):93-109．

[8]Rah B,Amin H,Yousuf K,et al．A novel MMP-2 inhibitor 3-azidowithaferin A (3-azidoWA)abrogates cancer cell invasion and angiogenesis by modulating extracellular Par-4[J]．PloS one,2012, 7(9):e44039．

[9]Cui J,Chen S,Zhang C,et al．Inhibition of MMP-9 by a selective gelatinase inhibitor protects neurovasculature from embolic focal cerebral ischemia[J]．Molecular neurodegeneration,2012,7:21．

[10]Oyanagi J,Ogawa T,Sato H,et al．Epithelial-mesenchymal transition stimulates human cancer cells to extend microtubule-based invasive protrusions and suppresses cell growth in collagen gel[J]．PloS one,2012,7(12):e53209．

Laminin α4(LAMA4)regulates proliferation and invasion of laryngeal carcinoma Hep-2 cells

ObjectiveTo investigate the effects of laminin α4(LAMA4)on proliferation and invasion of laryngeal carcinoma Hep-2 cells．Methods Recombinant lentiviral vector with completed LAMA4 gene and LAMA4 siRNA sequences combined with GFP were constructed,respectively．Both of them were transfected into Hep-2 cells．The over-expression and knock-down rates were verified by western blot．MTT and Transwell assays were performed to determine the proliferation and invasion ability of transfected Hep-2 cells．The expressions of MMP-2,MT1-MMP proteins and mRNA were evaluated by Western blot and real-time PCR．Results Recombinant lentiviruses with LAMA4 gene and LAMA4 siRNA were successfully constructed．The virus titer was 5×105TU/μl．Lentivirus-mediated LAMA4 and LAMA4 siRNA were transfected into Hep-2 cells．Lower LAMA4 expression was detected in LAMA4 siRNA group,while over-expression was detected in LAMA4 group as compared to the control group(P＜0．05)．No effect on cell proliferation was detected in both LAMA or LAMA4 siRNA-transfected Hep-2 cells．Compared to control group the invasive ability of Hep-2 cells was increased in LAMA4 over-expression group and reduced in LAMA4 knock-down group(P＜0．05);meanwhile the expression of MMP-2,MT1-MMP proteins and mRNA levels were increased in LAMA4 over-expression group and decreased in LAMA4 knockdown group(P＜0．05)．Conclusion LAMA4 may be involved in the invasion of laryngeal carcinoma Hep-2 cells by regulating MMP-2 and MT1-MMP expression,suggesting that LAMA4 would be a potential therapeutic target for laryngocarcinoma．

Gene Laryngocarcinoma Lentivirus Invasion Proliferation

2013-11-06）

（本文編輯：歐陽卿）

寧波市科技創新團隊項目（2012B82019）

315040 寧波大學醫學院附屬李惠利醫院耳鼻喉科（鄔振華、沈志森）；寧波大學醫學院生物化學與分子生物學研究所（李群、龔朝暉）