A型肉毒毒素對(duì)大鼠前列腺增生組織中缺氧誘導(dǎo)因子-1α及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子表達(dá)的影響

周鵬 張心男 徐智慧

A型肉毒毒素對(duì)大鼠前列腺增生組織中缺氧誘導(dǎo)因子-1α及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子表達(dá)的影響

周鵬 張心男 徐智慧

目的 探討A型肉毒毒素（BTX-A）對(duì)大鼠前列腺增生組織中缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）表達(dá)的影響。方法取60只大鼠，實(shí)驗(yàn)組45只，空白對(duì)照組15只。實(shí)驗(yàn)組大鼠均制作前列腺增生模型，1周后兩組均隨機(jī)處死5只大鼠觀察建模是否成功。實(shí)驗(yàn)組剩余大鼠隨機(jī)分為高劑量組（注射10U/0．1ml BTX-A）、中劑量組（注射6U/0．1ml BTX-A）、低劑量組（注射2U/0．1ml BTX-A）、陰性對(duì)照組（注射0．1ml0．9%氯化鈉溶液），術(shù)后各組繼續(xù)給予長效雄激素（十一酸睪酮針4mg· kg-1·d-1）維持，空白對(duì)照組仍給予等量橄欖油皮下注射。4周后處死各組大鼠，取出前列腺稱重，免疫組化法檢測比較各組大鼠前列腺組織中HIF-1α和VEGF的表達(dá)情況。結(jié)果大鼠前列腺增生模型建立成功。實(shí)驗(yàn)組大鼠HIF-1α在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核均有表達(dá)，在新生血管周圍表達(dá)明顯增強(qiáng)，而VEGF的表達(dá)主要在細(xì)胞質(zhì)中。與空白對(duì)照組比較，其他各組大鼠前列腺濕重均發(fā)生明顯變化，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05）；與陰性對(duì)照組比較，低、中、高劑量組大鼠前列腺濕重均發(fā)生明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05）。空白組及陰性對(duì)照組均未見HIF-1α的表達(dá)；與空白對(duì)照組比較，高、中、低劑量組VEGF及HIF-1α的陽性表達(dá)率及灰度值、陰性對(duì)照組VEGF灰度值均發(fā)生明顯變化（均P＜0．05）；與陰性對(duì)照組比較，中、低劑量組VEGF及HIF-1α的陽性表達(dá)率和高、中、低劑量組VEGF及HIF-1α的灰度值均發(fā)生明顯變化（均P＜0．05）；與低劑量組比較，高、中劑量組VEGF及HIF-1α的陽性表達(dá)率及灰度值均發(fā)生明顯變化（均P＜0．05）；與中劑量組比較，高劑量組VEGF的陽性表達(dá)率及灰度值和HIF-1α的陽性表達(dá)率均發(fā)生明顯變化（均P＜0．05）。實(shí)驗(yàn)組大鼠HIF-1α與VEGF的表達(dá)呈明顯正相關(guān)關(guān)系（r=0．575，P＜0．01）。結(jié)論前列腺內(nèi)注射BTX-A可以通過抑制HIF-1α和VEGF的表達(dá)，從而抑制前列腺組織的血管形成，促使前列腺縮小。

前列腺增生 A型肉毒毒素 缺氧誘導(dǎo)因子-1α 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子

良性前列腺增生（月PH）是老年男性常見病，目前其臨床治療主要以藥物、手術(shù)治療為主，但都存在一定不良反應(yīng)。因此尋找一種安全、有效、不良反應(yīng)小、微創(chuàng)的月PH治療方法十分必要[1]。國外已有學(xué)者利用A型肉毒毒素（月TX-A）的去神經(jīng)化對(duì) 月PH患者行前列腺內(nèi)月TX-A注射治療，但對(duì)其具體使用方法及可能的作用機(jī)制尚未闡明。本研究通過將不同劑量月TX-A注射于月PH大鼠前列腺腺體后，檢測其對(duì)于缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）蛋白表達(dá)的影響，旨在明確月TX-A對(duì)前列腺組織血管形成方面可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 動(dòng)物：健康清潔級(jí)Wistar雄性大鼠60只，體重（200±25）g；由中科院上海動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，顆粒飼料喂養(yǎng)。試劑：丙酸睪丸酮注射液為廣州制藥有限公司產(chǎn)品；十一酸睪酮注射液為浙江仙居制藥有限公司產(chǎn)品；月TX-A為中國生物技術(shù)集團(tuán)公司蘭州生物制品研究所產(chǎn)品。使用時(shí)配成所需濃度。即用型SP試劑盒及DA月顯色劑均購自福州邁新公司，HIF-1α濃縮液單克隆抗體購于Labvision公司，抗體滴度1∶100。

1.2 動(dòng)物分組及處理 采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只大鼠分為空白對(duì)照組（15只）及實(shí)驗(yàn)組（45只）。實(shí)驗(yàn)組大鼠手術(shù)切除雙側(cè)睪丸，給予皮下注射十一酸睪酮針4mg/（d·kg）建模，連續(xù)1周；空白對(duì)照組給予手術(shù)暴露睪丸，皮下注射等量的橄欖油，連續(xù)1周。1周后隨機(jī)處死5只實(shí)驗(yàn)組及5只空白對(duì)照組大鼠，進(jìn)行HE染色，由2位病理科醫(yī)師依據(jù)光鏡觀察判斷大鼠前列腺增生模型是否建模成功。確定建模成功后，實(shí)驗(yàn)組剩余大鼠再次隨機(jī)分為高劑量組（注射10U/0.1ml月TXA）、中劑量組（注射6U/0.1ml月TX-A）、低劑量組（注射2U/0.1ml月TX-A）、陰性對(duì)照組（注射0.1ml0.9%氯化鈉溶液），術(shù)后各組繼續(xù)給予長效雄激素維持（十一酸睪酮針4mg·kg-1·d-1），空白對(duì)照組仍給予等量橄欖油皮下注射。并于術(shù)后4周觀察大鼠的反應(yīng)。最終處死所有大鼠，稱取大鼠凈重，并取出前列腺組織，分析天平稱取腺體。

1.3 結(jié)果判定 常規(guī)固定，石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察組織病理學(xué)改變。采用免疫組化SP法對(duì)切片染色，每張切片隨機(jī)選取高倍（×100）視野下5～10個(gè)視野，計(jì)算100個(gè)細(xì)胞的陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值，以百分?jǐn)?shù)表示表達(dá)率。應(yīng)用月LTDMC-2080病理圖文分析系統(tǒng)計(jì)算切片所選視野的灰度值用以評(píng)價(jià)免疫組化結(jié)果的陽性信號(hào)強(qiáng)弱，從而對(duì)于染色結(jié)果進(jìn)行客觀定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料均以表示，組間比較采用方差分析，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下HE染色觀察結(jié)果 見圖1。

圖1 大鼠前列腺增生組織HE染色情況（A：×50；B：×100）

由圖1可見，實(shí)驗(yàn)組大鼠1周時(shí)前列腺組織腺體排列明顯密集、腺腔呈鋸齒擴(kuò)張明顯、呈乳頭狀增生突向腺腔內(nèi)，提示大鼠前列腺增生模型建立成功。

2.2 光鏡下大鼠前列腺組織免疫組化染色觀察結(jié)果 見圖2。

圖2 大鼠前列腺組織免疫組化染色情況（A：HIF-1α在高劑量組大鼠前列腺組織呈弱陽性表達(dá)；B：HIF-1α在中劑量組大鼠前列腺組織呈陽性表達(dá)；C：新生血管旁HIF-1α在低劑量組大鼠前列腺組織呈陽性表達(dá)；D：VEGF在高劑量組大鼠前列腺組織呈弱陽性表達(dá)；E：VEGF在中劑量組大鼠前列腺組織呈陽性表達(dá)；F：VEGF在低劑量組大鼠前列腺組織呈陽性表達(dá)；SP法，×100）

由圖2可見，實(shí)驗(yàn)組大鼠HIF-1α在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核均有表達(dá)，在新生血管周圍表達(dá)明顯增強(qiáng)，而VEGF的表達(dá)主要在細(xì)胞質(zhì)中。

2.3 各組大鼠凈重及前列腺濕重的比較 見表1。

表1 5組大鼠凈重及前列腺重量的比較

由表1可見，各組大鼠凈重的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。與空白對(duì)照組比較，其他各組大鼠前列腺濕重均發(fā)生明顯變化，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與陰性對(duì)照組比較，低、中、高劑量組大鼠前列腺濕重均發(fā)生明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.4 各組大鼠HIF-1α及VEGF表達(dá)情況的比較 見表2。

表2 各組大鼠HIF-1α及VEGF表達(dá)情況的比較

由表2可見，空白組及陰性對(duì)照組均未見HIF-1α的表達(dá)；與空白對(duì)照組比較，高、中、低劑量組VEGF及HIF-1α的陽性表達(dá)率及灰度值、陰性對(duì)照組VEGF灰度值均發(fā)生明顯變化，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與陰性對(duì)照組比較，中、低劑量組VEGF及HIF-1α的陽性表達(dá)率和高、中、低劑量組VEGF及HIF-1α的灰度值均發(fā)生明顯變化，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與低劑量組比較，高、中劑量組VEGF及HIF-1α的陽性表達(dá)率及灰度值均發(fā)生明顯變化，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組VEGF的陽性表達(dá)率及灰度值和HIF-1α的陽性表達(dá)率均發(fā)生明顯變化，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.5HIF-1α與VEGF表達(dá)的相關(guān)性 實(shí)驗(yàn)組大鼠HIF-1α與VEGF的表達(dá)呈明顯正相關(guān)關(guān)系（r=0.575，P＜0.01）。

3 討論

月TX是梭狀芽孢桿菌產(chǎn)生的一種嗜神經(jīng)毒素，可作用于膽堿能神經(jīng)末梢，抑制乙酰膽堿的釋放和傳遞，產(chǎn)生去神經(jīng)化作用，導(dǎo)致肌肉松弛麻痹；大劑量注射則會(huì)引起肌肉萎縮。既往的文獻(xiàn)報(bào)道多集中于尿道括約肌及膀胱逼尿肌的應(yīng)用，近年來越來越多的目光轉(zhuǎn)向前列腺疾病。Chuang等[2]通過對(duì)SD大鼠模型前列腺組織的腹側(cè)葉給予不同劑量的月TX-A注射，再分別間隔1～2周，分別應(yīng)用免疫組化和TUNEL及Western blot分別檢測其對(duì)于細(xì)胞增殖、凋亡的影響，結(jié)果顯示高劑量月TX-A能顯著減少前列腺體積，增加細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，與Lin等[3]的研究結(jié)果相似。在文結(jié)果亦顯示，隨著腺體內(nèi)月TX-A劑量的逐步增大，前列腺的體積逐漸縮小，濕重也逐步降低。

既往對(duì)于肉毒毒素的前列腺疾病治療的理論依據(jù)在于前列腺腺體內(nèi)注射后觀察到腺體有萎縮現(xiàn)象，所引起前列腺萎縮多用其封閉局部交感或副交感神經(jīng)末梢分泌的腎上腺素或乙酰膽堿來解釋，作用機(jī)制為去神經(jīng)化后所致細(xì)胞凋亡。目前，隨著對(duì)血管形成因素的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)前列腺增生組織也和實(shí)體瘤一樣取決于新生血管及微環(huán)境的改變，尤其是去勢之后，前列腺組織內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致局部組織缺血，前列腺腺上皮細(xì)胞凋亡。HIF-1α就是新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)非常重要的調(diào)節(jié)因子，它對(duì)VEGF的調(diào)控主要是通過與一種特異的VEGF DNA低氧性應(yīng)答物質(zhì)連接，進(jìn)而促進(jìn)mRNA的轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)mRNA穩(wěn)定性，從而增加VEGF的表達(dá)[4]。

Rudolfsson等[5]的研究表明，通過Western blot技術(shù)可以檢測到去勢前后HIF-1α蛋白相差近20倍。劉孝東等[6]發(fā)現(xiàn)，VEGF蛋白在大鼠前列腺的血管內(nèi)皮及腺上皮細(xì)胞上均有表達(dá)。SD大鼠去勢后，其前列腺組織中的VEGF及其受體FLK-1的蛋白表達(dá)明顯降低，而給去勢后大鼠注射外源性睪酮，VEGF及其受體FLK-1的蛋白表達(dá)又明顯升高，表明睪酮可正向調(diào)節(jié)大鼠前列腺組織中VEGF的表達(dá)。Nishiyama等[7]研究發(fā)現(xiàn)，切除大鼠的雙側(cè)睪丸后，前列腺內(nèi)的血流急劇減少，術(shù)后18h血流減少35%，24h減少50%。說明雄激素去除可能對(duì)大鼠前列腺的微血管造成影響，若立即給予睪酮?jiǎng)t不發(fā)生上述現(xiàn)象。去勢后的大鼠，最早出現(xiàn)凋亡的細(xì)胞是大量的前列腺血管內(nèi)皮細(xì)胞，若再給予睪酮，首先發(fā)生增殖的細(xì)胞為前列腺血管內(nèi)皮細(xì)胞而非上皮細(xì)胞，說明血管內(nèi)皮細(xì)胞才是前列腺中睪酮的最初靶細(xì)胞[8]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在大鼠前列腺增生組織中由于局灶性缺氧的存在，可以檢出有HIF-1α表達(dá)，隨著月TXA的劑量的加大，VEGF和HIF-1α的表達(dá)明顯降低，提示其可能存在與血管生成有關(guān)的調(diào)控機(jī)制。有關(guān)月TXA與HIF-1α、VEGF及血管新生關(guān)系的機(jī)制可能為：隨著前列腺的不斷生長、體積增大，血供不足發(fā)生缺氧壞死，誘導(dǎo)HIF-lα過度表達(dá)，而HIF-1α能增強(qiáng)其下游靶基因VEGF的表達(dá)，活化的HIF-1α與靶基因上的HIF-1α結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，從而啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄和相應(yīng)的蛋白產(chǎn)物增加，VEGF表達(dá)增加，VEGF進(jìn)而作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的VEGFRI和VEGFR2，從而激活了一系列的缺氧轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)新生血管的形成，而月TX則是通過作用于HIF-1α之前來調(diào)控血管形成。但在對(duì)大鼠前列腺體積的分析中，筆者發(fā)現(xiàn)前列腺濕重降低并非與月TX-A的劑量成量效關(guān)系，其僅在低劑量及高劑量組間有差別，仍需增加樣本量或者調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)分組來證實(shí)。另外，本文結(jié)果與Anger[9]等及Safari[10]等的既往研究結(jié)果有所矛盾，提示膀胱逼尿肌細(xì)胞與前列腺內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)于月TX的作用靶點(diǎn)不同，仍需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

目前，關(guān)于月TX-A注射與局部新生血管形成及細(xì)胞微環(huán)境改變的研究國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過研究肉毒毒素在Wistar大鼠前列腺模型中的表達(dá)，提示肉毒毒素通過血管因素調(diào)節(jié)前列腺增生。但是由于嚙齒動(dòng)物與人在解剖上的差異，體外培養(yǎng)與體內(nèi)環(huán)境的不同，各組實(shí)驗(yàn)報(bào)道中應(yīng)用月TX-A的劑量不盡相同，如何選取最小劑量，仍需在劑型、給藥方式等方面做出改進(jìn)。但可以肯定的是，月TX-A注射作為一種微創(chuàng)、安全的方法，對(duì)于廣大前列腺疾病患者改善癥狀具有重要意義，但不良反應(yīng)及遠(yuǎn)期效果仍需進(jìn)一步觀察。

[1]Ilie C P,Chancellor M B．Perspective of Botox for treatment of male lowerurinarytractsymptoms[J]．CurrOpinUrol,2009,19(1):20-25．

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[3]Lin VK．Botulinum toxin and cellular proliferation in the prostate[J]．J Urol,2006,175(3 Pt 1):817．

[4]Liu L,Ai J,Xiao W,et al．ELL is an HIF-1alpha partner that regulates and responds to hypoxia response in PC3 cells[J]．Prostate, 2010,70(7):797-805．

[5]Rudolfsson S H,Bergh A．Testosterone-stimulated growth of the rat prostate may be driven by tissue hypoxia and hypoxia-inducible factor-1alpha[J]．J Endocrinol,2008,196(1):11-19．

[6]劉孝東,董強(qiáng)．睪酮對(duì)血管內(nèi)皮生長因子及其受體在大鼠前列腺組織中表達(dá)的影響[J]．華西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2002,33（2）:226-228．

[7]Nishiyama Y,Yokoyama T,Tomizawa K,et al．Effects of purified newly developed botulinum neurotoxin type A in rat prostate[J]．Urology,2009,74(2):436-439．

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[9]Safari S,Jamali S,Habibollahi P,et al．Intravesical injections of botulinum toxin type A for management of neuropathic bladder:a comparison of two methods[J]．Urology,2010,76(1):225-230．

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（本文編輯：歐陽卿）

《浙江醫(yī)學(xué)》對(duì)圖表的要求

稿件中若有圖表，分別按其在正文中出現(xiàn)的先后次序連續(xù)編碼。每幅圖應(yīng)冠有圖題。說明性的文字應(yīng)置于圖下方注釋中，并在注釋中標(biāo)明圖表中使用的全部非公知公用的縮寫。線條圖應(yīng)墨繪在白紙上，高寬比例以5∶7為宜。以計(jì)算機(jī)制圖者應(yīng)提供激光打印圖樣。照片圖要求有良好的清晰度和對(duì)比度；圖中需標(biāo)注的符號(hào)（包括箭頭）請用另紙標(biāo)上，不要直接寫在照片上。每幅圖的背面應(yīng)貼上標(biāo)簽，注明圖號(hào)、方向及作者姓名。若刊用人像，應(yīng)征得本人的書面同意，或遮蓋其能被辨認(rèn)出系何人的部分。大體標(biāo)本照片在圖內(nèi)應(yīng)有尺度標(biāo)記。病理照片要求注明染色方法和放大倍數(shù)。圖表中如有引自他刊者，應(yīng)注明出處。電子版投稿中圖片建議采用JPG格式。表格建議采用三橫線表（頂線、表頭線、底線），如遇有合計(jì)和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理內(nèi)容（如 值值等），則在此行上面加一條分界橫線；表內(nèi)數(shù)據(jù)要求同一指標(biāo)有效位數(shù)一致，一般按標(biāo)準(zhǔn)差的1/3確定有效位數(shù)。

本刊編輯部

Effect of botulinum toxin type A on expression of HIF-1α and VEGF in rat prostatic tissue of hyperplasia

Objective To investigate the effect of botulinum toxin type A(BTX-A)on the expression of HIF-1a and VEGF in rat prostatic tissues of hyperplasia．MethodsSixty Wistar rats were randomly divided into experimental(n=45)and control (n=15)groups．Orchietectomy was performed in experimental group and androgen 4mg·kg-1·d-1was administrated;the sham operation was performed in control group and liver oil was given instead．Five rats were sacrificed in each group to observe the hyperplasia in prostate glands after 1 week．Different doses of BTX-A were injected in the prostate of the castrated rats in H-dose(10U/0．1ml,n=10),M-dose(6U/0．1ml,n=10),L-dose(2U/0．1ml,n=10)and NS(NS/0．1ml,n=10)groups．After 4 weeks rats were sacrificed and the prostate glands were taken for weighting,the expression of HIF-1α and VEGF were analyzed by immunohistochemical technique．ResultsThe HIF-1α detected in cytoplasm and nucleus,especially around the new vessels, the VEGF was detected only in cytoplasm．The weight of prostate in 4 experimental groups were significant higher than that in control group (P＜0．05)．The positive rate and grey value of HIF-1α and VEGF in H-,M-and L-dose groups and VEGF in NS group were significantly higher than those in control group(P＜0．05)．The positive rate and grey values of HIF-1α and VEGF in H-,M-and L-dose groups were significantly higher than those in NS group(P＜0．05)．There were also significant differences in positive rate and grey values of HIF-1α and VEGF among H-,M-and L-dose groups(P＜0．05)．The HIF-1α expression was closely correlated with VEGF expression(r=0．575,P＜0．01)．ConclusionBTX-A can regulate the expression of HIF-1α andVEGF of prostatic tissues,resulting in the inhibition of vascularization and attenuating hyperplasia of prostate gland．

Prostatic hyperplasia Type A botulinum toxin Hypoxia inducible factor-1α Vascular endothelial growth factor

2013-05-03）

310009 杭州市第三人民醫(yī)院泌尿外科（周鵬）；浙江省立同德醫(yī)院泌尿外科（張心男）；浙江省人民醫(yī)院泌尿外科（徐智慧）