Wnt信號(hào)通路的β-catenin和拮抗因子SFRP1在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及意義

章輝 曹學(xué)全 戴岳楚 盧洪勝

Wnt信號(hào)通路的β-catenin和拮抗因子SFRP1在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及意義

章輝 曹學(xué)全 戴岳楚 盧洪勝

目的 探討Wnt信號(hào)通路的β-catenin和拮抗因子SFRP1在甲狀腺乳頭狀癌（PTC）中的表達(dá)及意義。方法采用免疫組化PV-8000法檢測(cè)78例PTC組織和24例正常甲狀腺組織中β-catenin和Wnt拮抗因子SFRP1蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果PTC組織中β-catenin陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常甲狀腺組織（P＜0.01），而Wnt拮抗因子SFRP1蛋白在PTC組織中陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于正常甲狀腺組織（P＜0.01）。β-catenin和Wnt拮抗因子SFRP1蛋白表達(dá)均與PTC臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者年齡有關(guān)（P＜0.05或0.01），而均與患者性別、腫瘤大小無關(guān)（均P＞0.05）。Spearman相關(guān)分析顯示在PTC組織中兩者之間表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。結(jié)論β-catenin和SFRP1蛋白表達(dá)異?？赡芘cPTC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。兩種蛋白聯(lián)合檢測(cè)對(duì)判斷PTC的惡性程度和病情進(jìn)展有重要價(jià)值。

甲狀腺乳頭狀癌 Wnt/β-catenin SFRP1

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌腫瘤之一，甲狀腺癌在全球發(fā)病率每年增長(zhǎng)約4%[1-2]。我國(guó)沿海省份是甲狀腺癌的高發(fā)地區(qū)，女性發(fā)病率明顯高于男性，其中甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）占80%。PTC屬于高分化腫瘤、侵襲性較弱、預(yù)后較好。但在臨床工作中我們也發(fā)現(xiàn)，有一些PTC甚至是微小PTC的患者在初診時(shí)就出現(xiàn)大量的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，表現(xiàn)出較高的侵襲性。因此，進(jìn)一步研究PTC的發(fā)病機(jī)制及早期診斷十分必要。

近年在腫瘤干細(xì)胞的研究上，經(jīng)典Wnt/β-catenin通路對(duì)癌干細(xì)胞的影響成為熱點(diǎn)[3-4]。研究顯示，βcatenin是一種多功能的漿蛋白質(zhì)，在細(xì)胞連接處與E-cadherin相互作用，參與形成粘合帶；而游離的βcatenin進(jìn)入胞核，調(diào)節(jié)基因表達(dá)。Wnt信號(hào)通路重要的拮抗因子SFRP1，可與受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Wnt蛋白，或直接與Wnt蛋白結(jié)合，從而阻斷了Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。故我們研究了 Wnt信號(hào)通路的 β-catenin和拮抗因子SFRP1在PTC中的表達(dá)及意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 選取本院2012-02—2013-12經(jīng)手術(shù)切除并且具有完整病史的PTC石蠟包埋組織78例，男23例，女55例，年齡18～80歲，中位年齡49歲；所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放、化療及內(nèi)分泌治療。TNM（UICC）分期：Ⅰ期患者44例、Ⅱ期19例、Ⅲ～Ⅳ期15例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例。另取同期癌旁3～5cm處的正常甲狀腺組織24例作對(duì)照。所有切片經(jīng)病理科多位診斷醫(yī)師閱片證實(shí)。所做標(biāo)本均經(jīng)10%中性緩沖甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 β-catenin鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司，兔抗人SFRP1多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)santa cruz公司（工作濃度1∶100稀釋），PV-8000染色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司。

1.3 方法 常規(guī)4μm連續(xù)切片，切片經(jīng)60～70℃烤箱30min烤片后，二甲苯脫蠟，梯度酒精至水。本實(shí)驗(yàn)采用EDTA液中熱修復(fù)方法10～20min，室溫下自然冷卻，蒸餾水洗，滴加3%H2O2溶液10min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS液沖洗3×3min，滴加一抗后置4℃冰箱過夜；PBS液沖洗3×3min，滴加二抗，室溫下15～20min；PBS液沖洗3×3min，DAB顯色劑顯色，蒸餾水沖洗、蘇木素襯染、1%鹽酸返藍(lán)；梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。用PBS液代替一抗作陰性對(duì)照，已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷 β-catenin以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，SFRP1蛋白以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒染色為陽(yáng)性細(xì)胞（核中亦有少量表達(dá)）。400倍視野下選擇5個(gè)以上高倍鏡視野，連續(xù)計(jì)數(shù)1 000個(gè)癌細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%為陰性，≥10%為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，變量間的關(guān)系采用spearman相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 β-catenin和SFRP1在PTC和正常甲狀腺組織中的表達(dá) β-catenin陽(yáng)性表達(dá)（圖1）；SFRP1陽(yáng)性表達(dá)（圖2）。β-catenin、SFRP1的陽(yáng)性表達(dá)率在正常甲狀腺組織中分別為8.33%（2/24）和75.00%（18/24），PTC組織中分別為67.95%（53/78）和29.49%（23/78），兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=27.787、15.815，均P＜0.01）。

2.2 β-catenin、SFRP1陽(yáng)性與PTC臨床病理特征的關(guān)系 見表1。

由表1可見，β-catenin和SFRP1陽(yáng)性分別與PTC臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者年齡有關(guān)（P＜0.05或0.01），而與患者性別、腫瘤大小均無關(guān)（均P＞0.05）。2.3 β-catenin、SFRP1在PTC組織中表達(dá)的關(guān)系 見表2。

圖1 β-catenin在PTC組織中表達(dá)（免疫組化PV-8000法，×200）

圖2 SFRP1在PTC組織中表達(dá)（免疫組化PV-8000法，×200）

表1 β-catenin、SFRP1陽(yáng)性與PTC臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

表2 β-catenin、SFRP1在PTC組織中表達(dá)的關(guān)系（例）

由表2可見，β-catenin和SFRP1蛋白在PTC組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

3 討論

細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路廣泛存在于多細(xì)胞真核生物中，是一條高度保守的信號(hào)通路。其中經(jīng)典Wnt通路[3]：通過β連環(huán)蛋白（β-catenin）的核異位，激活靶基因的轉(zhuǎn)錄活性。眾多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[5-7]，β-catenin穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)是Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的核心機(jī)制。Wnt蛋白因子通過膜受體卷曲蛋白（Frizzled，F(xiàn)ZD）和LRPS/LRP6輔助受體結(jié)合，促動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，使β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)累積，然后進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核內(nèi)，β-catenin與T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子（TCF）/淋巴增強(qiáng)因子（LEF）共同結(jié)合復(fù)合體TCF/LEF-β-catenin-Legless-YGO，充當(dāng)著許多基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器，從而激活下游靶基因c-myc、Cyclin D1的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化增殖[8]。β鏈接素（β-catenin）既是Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵調(diào)整控點(diǎn)，又是上皮鈣黏附素復(fù)合體的重要組分，與腫瘤的發(fā)生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究對(duì)78例PTC病例進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示β-catenin在PTC組織67.95%（53/78）的表達(dá)，高于正常甲狀腺組織8.33%（2/24），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示β-catenin是一種促癌細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的基因蛋白。通過β-catenin與PTC臨床病理特征分析結(jié)果顯示，β-catenin表達(dá)與PTC臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者年齡有相關(guān)性，而與患者性別、腫瘤大小無關(guān)。推測(cè)β-catenin可能與PTC的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及發(fā)病年齡有關(guān)。

Wnt拮抗因子SFRP1是分泌型糖蛋白家族之一，定位于染色體8p12-11.1。SFRP1蛋白可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制Fz受體而抑制Wnt信號(hào)通路的活動(dòng)，是Wnt信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)劑。它通過干擾配體-受體間的相互作用而阻斷Wnt信號(hào)通路，從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，增殖[9-11]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SFRP1蛋白在PTC組織中表達(dá)的陽(yáng)性率29.49%（23/78），明顯低于正常甲狀腺組織的75.00%（18/24），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果與眾多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[10-12]，SFRP1基因調(diào)節(jié)失控導(dǎo)致各種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的觀點(diǎn)相一致。通過SFRP1蛋白與PTC臨床病理特征分析結(jié)果顯示，SFRP1蛋白表達(dá)與PTC臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者的發(fā)病年齡有相關(guān)性，而與患者性別、腫瘤大小無關(guān)。提示SFRP1蛋白可能與PTC的轉(zhuǎn)移、預(yù)后及患者年齡呈負(fù)相關(guān)性。

綜上所述，在PTC組織中β-catenin的高表達(dá)和SFRP1蛋白的低表達(dá)，兩者呈負(fù)相關(guān)性。提示β-catenin和SFRP1蛋白可通過對(duì)經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路的正負(fù)調(diào)控，傳導(dǎo)或阻斷Wnt信號(hào)通路，從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。聯(lián)合檢測(cè)β-catenin和 SFRP1蛋白有望成為判斷甲狀腺乳頭狀癌預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)，也有可能為甲狀腺乳頭狀癌的早期診斷和臨床治療開辟一條新途徑。

[1]Yin D T,Wang L,Sun J,et al.Homozy deletion but not mutation of exons 5 and 8 of the fragile histidine triad(FHIT)gene is associated with features of differentiated thyroid carcinoma[J].Ann Clin Lab Sci,2010,40(3):267-272.

[2]Jung K W,Park S,Shin A,et al.Do female cancer patients display better survival rates compared with males?Analysis of the Korean national registry data,2005-2009[J].PLoS One,2012,7(12): e52457.

[3]Mac Donald B T,Tamai K,He X.Wnt/β-catenin signaling:components,mechanisms,and diseases[J].Dev Cell,2009,17(1):9-26.

[4]DiMeo T A,Anderson K,Phadke P,et al.A Novel Lung Metastasis Signature Links Wnt Signaling with Cancer Cell Self-Renewal and Epithelial-Mesenchymal Transition in Basal-like Breast Cancer [J].Cancer Res,2009,4(4):246-247.

[5]Zhang X Y,Yang Y J,Xu P R,et al.The role of β-catenin signaling pathway on proliferation of rats neural stem cells after hyperbaric Oxygen therapy in vitro[J].Cell Mol Neurobiol,2011,31(1):101-109. [6]Xu H T,Wei Q,Liu Y,et al.Overexpression of axin downregulates TCF-4 and inhibits the development of lung cancer[J].Ann Surg Oncol,2007,14(11):3251-3259.

[7]Ma Y,Zhang G,Fu X,et al.Wnt signaling may be activated in a subset of Peutz-Jeghers syndrome polyps closely correlating to LKB1 expression[J].Oncol Rep,2010,23(6):1569-1576.

[8]Xu H T,Wei Q,Liu Y,et al.Overexpression of axin downregulates TCF-4 and inhibits the development of lung cancer[J].Ann Surg Oncol,2007,14(11):3251-3259.

[9]Bu X M,Zhao C H,Dai X W.Aberrant expression of Wnt antagonist SFRP1 in pancreatic cancer[J].Chin Med J,2008,12l(10):952-955. [10]Zou H,Molina J R,Harrington J J,et al.Aberrant methylation of secreted frizzled-related protein genes in esophageal adenocarcinoma and Barrett,s esophagus[J].IntJ Cancer,2005,116(4): 584-591.

[11]Qi J,Zhu Y Q,Luo J,et al.Hypermethylation and expression regulation of secreted frizzled-related protein genes in colorectal tumor[J].World J Gastroenterol,2006,12(44):7113-7117.

[12]Saini S,Liu J,Yamamura S,et al.Functional significance of secreted Frizzled-related protein 1 in metastatic renal cell careinomas [J].Cancer Res,2009,69(17):6815-6822.

Expression of β-catenin and antagonist factor SFRP1 in papillary thyroid carcinoma and its clinicopathological significance

ObjectiveTo investigate the expression of β-catenin of Wnt signaling pathway and its antagonist factor SFRP1 in papillary thyroid carcinoma(PTC)and its clinicopathological significance.MethodsThe expression of β-catenin and SFRP1 was detected by immunohistochemical PV-8000 method in 78 cases of papillary thyroid carcinoma and 24 samples of normal thyroid tissue.Resultsβ-catenin expression in PTC was significantly higher and SFRP1 expression was lower than that in normal thyroid tissue(both P＜0.01).The expression of β-catenin and SFRP1 in PTC was correlated with clinical stage and lymph node metastasis and age of the patients(P＜0.05 or P＜0.01)，while not correlated with sex and tumor size.Spearman correlation analysis showed that there was a negative correlation between β-catenin and SFRP1 expression in PTC(P＜0.01).ConclusionThe abnormal expression of β-catenin and SFRP1 may be involved in the pathogenesis of PTC.The combined detection of two proteins would help to assess the malignant degree and progression of PTC.

Papillary thyroid Carcinoma β-catenin SFRP1

2014-03-19）

（本文編輯：沈昱平）

318000 臺(tái)州市中心醫(yī)院病理科（章輝、曹學(xué)全、盧洪勝），甲狀腺乳腺外科（戴岳楚）

戴岳楚，E-mail：daiyc@enzemed.com