胃癌組織中水通道蛋白1、微血管密度與細胞脹亡的關系及臨床意義

盧明東 李丕宏 孫維建 黃和 俞耀軍 鄭志強

胃癌組織中水通道蛋白1、微血管密度與細胞脹亡的關系及臨床意義

盧明東 李丕宏 孫維建 黃和 俞耀軍 鄭志強

目的 探討胃癌組織中水通道蛋白1（AQP1）、微血管密度（MVD）與細胞脹亡的關系及臨床意義。方法采用免疫組化法、蛋白印跡法檢測55例胃癌、22例胃正常組織中AQP1的表達，Ⅷ因子相關抗原多克隆抗體標記血管內皮細胞法計數MVD，透射電鏡觀測細胞脹亡情況。隨訪并分析AQP1與胃癌患者預后的關系。結果胃癌組織中存在細胞脹亡；Ⅲ+Ⅳ臨床分期胃癌組織中的脹亡指數（OI）高于Ⅰ+Ⅱ臨床分期（P＜0.01）；淋巴結轉移組OI明顯高于無淋巴結轉移組（P＜0.05）。AQP1表達強度與MVD呈顯著正相關（P＜0.05）。在胃癌組織標本中，AQP1陽性表達率為58.2%，明顯高于正常胃組織（P＜0.01）。胃癌伴淋巴結轉移組AQP1表達水平明顯高于無淋巴結轉移組（P＜0.05）。多因素生存分析顯示AQP1表達、有無淋巴結轉移是預后的獨立危險因素（P＜0.05）。結論細胞脹亡和AQP1表達與胃癌的血管生成、生物學行為密切相關；AQP1可以作為判斷胃癌預后的臨床指標。

胃癌 水通道蛋白1 微血管密度 細胞脹亡

腫瘤產生的根本原因是細胞的不可控制生長和細胞死亡調控受限。腫瘤細胞的死亡包括細胞凋亡和細胞脹亡[1-2]，兩者均廣泛存在于腫瘤組織和正常組織中。細胞脹亡是近年來腫瘤研究方面的一大熱點，目前關于細胞脹亡在胃癌發生、發展中的作用國內外報道較少。有研究表明，水通道蛋白1（AQP1）在腫瘤細胞死亡、細胞遷移和血管新生的發生中起了重要作用[3]。本研究采用透射電鏡檢測胃癌細胞發生脹亡的情況，免疫組化法、蛋白印跡法檢測胃癌和胃正常組織中AQP1的表達、微血管密度（MVD），分析細胞脹亡與AQP1、MVD的關系，并探討其臨床意義，現報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2009-01—12我院經胃癌根治術切除的原發性胃癌組織標本55例，患者男26例，女29例；年齡30～77歲，平均（58.0±13.5）歲。有淋巴結轉移者38例，無淋巴結轉移者17例。胃癌TNM分期：Ⅰ期5例，Ⅱ期18例，Ⅲ期27例，Ⅳ期5例。所有患者術前均未行放療、化療及其他抗癌治療。同時選擇來源于胃潰瘍邊緣或胃良性腫瘤患者的正常胃組織22例，患者男13例，女9例，年齡29～70歲，平均（52.0±12.6）歲。標本采集后置-80℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 AQP1檢測 （1）AQP1定位：采用免疫組化法（SP染色），AQP1鼠抗（克隆號H0503，美國Santa Cruz公司產品），工作濃度為1∶80，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。以細胞膜或細胞質出現棕黃色顆粒為陽性細胞,無著色為陰性細胞。（2）AQP1半定量：采用蛋白印跡（western blot）法，取組織1g加入預冷的蛋白裂解液5ml，提取總蛋白。取50μg蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-15%聚丙烯酰胺凝膠電泳（100V，1.5h）。待溴酚藍進入凝膠底部后，將蛋白質印跡到硝酸纖維素膜上，用AQP1鼠抗人一抗1∶400和抗β-actin抗體孵育，過夜，TBST漂洗3次后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗（1∶5 000），室溫搖床孵育2h，一抗和二抗均為美國Santa Cruz公司產品。增強化學發光顯色系統顯色，暗室內X線底片感光成像，凝膠成像儀分析。

1.2.2 MVD檢測 采用兔抗人第Ⅷ因子相關抗原（FⅧ-RA）多克隆抗體（北京中山生物技術有限公司）進行SP法染色。先在低倍鏡下全面觀察切片以確定腫瘤內血管密度最高處，高密度血管多位于腫瘤邊緣，再在高倍鏡下，以與周圍腫瘤細胞、微血管和結締組織成分及其他連接組織成分明顯區別的任意1個棕色染色的內皮細胞或細胞叢作為1個血管，只要結構不相連，其分支結構也作為1個血管計數。管腔＞8個紅細胞、血管環形肌超過3層、硬化區域的血管、腫瘤壞死區、腫瘤細胞稀少區以及良性病變區的微血管不計數。計數10個染色最多的視野中微血管數，取其中最多的3個視野下的平均數作為單位面積血管數，即MVD。

1.2.3 脹亡細胞檢測 倒置光學顯微鏡觀察：將細胞按1.0×105個/孔濃度接種于6孔板,培養24h，光鏡下觀察。設立對照組。以PBS洗滌3次，1 500r/min離心5min，棄上清液，4℃2%戊二醛固定72h，1%俄酸固定，1%醋酸鈾塊染，丙酮梯度脫水，浸透包埋聚合，超薄切片，鈾及鉛雙重染色后透射電鏡下觀察。透射電鏡（日立1-7500型）下隨機計數1 000個腫瘤細胞中的脹亡細胞數,即為該組織的脹亡指數（oncosis index，OI）。

1.2.4 隨訪 所有患者出院后每6個月隨訪1次，電話隨訪與門診隨訪相結合（個別患者采用信件隨訪）；隨訪時間1～60個月，最后隨訪時間為2013年5月。

1.3 統計學處理 使用SPSS13.0統計軟件及凝膠圖像分析系統進行灰度分析。計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。計數資料組間比較采用χ2檢驗。AQP1表達與MVD的相關性采用Spearman等級相關檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存曲線的比較采用log-rank檢驗，預后影響因素的多因素分析采用Cox回歸。

2 結果

2.1 脹亡細胞形態學特征 在透射電鏡下觀察癌細胞，表現為細胞腫脹，體積增大，胞質空泡化，胞質內出現致密顆粒，內質網腫脹，線粒體早期可出現致密化，后期腫脹，絮狀改變或出現高致密顆粒，嵴破壞；細胞腫脹波及核，核內染色質分散，凝集在核膜、核仁周圍，有時聚集成團塊；胞膜起泡是脹亡早期事件，隨之胞膜通透性增加，胞膜崩解，詳見圖1。

圖1 胃癌細胞發生脹亡（A：細胞腫脹，胞質空泡化，胞質內出現致密顆粒；B：細胞腫脹波及核，核內染色質分散，凝集在核膜、核仁周圍；透射電鏡，×6 000）

2.2 脹亡與臨床病理指標關系 臨床分期Ⅲ+Ⅳ胃癌組織中OI高于Ⅰ+Ⅱ臨床分期（t=8.620，P＜0.01）；淋巴結轉移組OI明顯高于無淋巴結轉移組（t=2.789，P＜0.05）。不同TNM分期、病理類型、分化程度、腫瘤位置、腫瘤大小者OI的差異均無統計學意義（均P＞0.05），詳見表1。

2.3 AQP1表達與MVD、臨床病理特征的關系 AQP1主要表達于癌細胞及毛細血管和小血管內皮細胞的細胞膜上（圖2）。55例胃癌組織中32例表達陽性（58.2%），22例胃正常組織中僅有2例（9.1%）表達陽性，兩者比較差異有統計學意義（χ2=15.358，P＜0.01）。胃癌組織中的AQP1表達水平明顯高于胃正常組織，差異有統計學意義（t=2.691，P＜0.05）。同時在淋巴結轉移陽性和陰性的胃癌組織中，AQP1表達水平的差異有統計學意義（t=2.927，P＜0.05）。不同TNM分期、病理類型、分化程度、腫瘤位置、腫瘤大小者AQPI水平的差異無統計學意義（均P＞0.05），詳見圖3、表1、2。有淋巴結轉移患者的MVD為24.11±10.73，明顯高于無淋巴結轉移患者的MVD 9.19±6.45，差異有統計學意義（t=3.273，P＜0.05）。經Spearman相關分析，55例淋巴結陽性的胃癌組織標本中AQP1陽性表達水平與MVD呈顯著正相關（r=0.734，P＜0.05）。

圖2 AQP1和MVD在胃癌中的表達（A：管狀腺，SP染色，×400；B：乳頭狀腺癌，SP染色，×200；C：MVD在胃癌中的表達，SP染色，×400）

表1 胃癌組織中臨床病理特征與AQP1、OI值的關系

表2 各組胃組織中AQP1表達水平的比較

圖3 各組胃組織中AQP1蛋白表達水平的比較

2.4 MVD、AQP1與細胞脹亡的關系 透射電鏡觀察胃癌組織，發現脹亡細胞集聚部分的MVD較疏，血供豐富處的脹亡細胞數量明顯減少。AQP1陽性表達者OI（0.73±0.39）低于陰性表達者（1.15±0.56），差異有統計學意義（t=4.112，P＜0.01）。

2.5 AQP1與預后 研究結束共收到53例隨訪資料，其中2例患者死于其他疾病。53例胃癌組織中，AQP1表達陽性30例，其半數生存期為23個月，表達陰性23例，其半數生存期為54個月，兩組患者的生存期差異有統計學意義（χ2=5.869，P＜0.05，圖4），提示AQP1的表達與胃癌患者的生存有關。浸潤深度、有無淋巴結轉移、臨床分期、AQP1表達與胃癌根治術患者的預后顯著相關。對53例胃癌患者的生存資料進行Cox回歸分析，結果顯示AQP1表達、有無淋巴結轉移是胃癌根治術患者預后的獨立危險因素（P＜0.05），詳見表3。

圖4 AQP1表達陽性和陰性胃癌患者的生存曲線

表3 53例胃癌患者預后危險因素的Cox分析結果

3 討論

細胞死亡方式包括：細胞凋亡和細胞脹亡[1]。細胞脹亡和腫瘤的發生、惡性化或者消退密切相關[2]。細胞脹亡與維持機體平衡、控制細胞數量、對抗異常細胞增殖等關系密切[2，4]。如果與此有關的生理機制出現異常或者障礙，就有可能發生腫瘤。應用透射電鏡觀察胃癌組織時，我們發現胃癌細胞存在細胞脹亡，說明細胞脹亡在胃癌的發生、發展起一定的作用。

AQP是一類存在于細胞膜上的水通透性蛋白，在哺乳動物各種組織細胞中廣泛分布，共13個成員（AQP0-12），AQP1為其中一員[5-6]。大量研究表明，AQP1在腫瘤細胞死亡、細胞遷移和血管新生中發揮重要作用[3，7-8]。我們前期的研究已經發現[9]，AQP1高表達的癌組織內細胞具有較強的轉移能力。在本研究中檢測55例胃癌組織中AQP1的表達情況，AQP1陽性表達者OI低于陰性表達者，可能通過AQP1對于細胞脹亡的抑制從而使細胞主動性死亡能力喪失。細胞脹亡率的下降使得腫瘤細胞凈生長率提高，從而導致腫瘤細胞增殖失控和惡性加劇，故認為AQP1可以作胃癌預后的指標。

腫瘤血管新生是一個復雜的過程，并受多種活性因子調控。MVD被認為是判斷惡性腫瘤進展和轉移潛力的指標。本研究發現，胃癌標本中AQP1陽性表達強度與MVD表達強度呈正相關，提示AQP1高表達可能與胃癌組織中血管生成有關。同時，細胞脹亡的發生與血液供應不足有關[10]。對MVD和AQP1的表達情況與胃癌臨床病理學特征的關系進行分析，發現兩者的過表達與較差生物學行為的胃癌相關，與細胞的脹亡存在一定的聯系。

綜上所述，本課題采用免疫組化法、蛋白印跡法檢測AQP1的表達，采用透射電鏡觀測細胞脹亡情況，并通過分析AQP1表達、MVD與脹亡、臨床病理特征的關系，初步證實細胞脹亡和AQP1表達與胃癌的血管生成、生物學行為有一定關系。但是限于隨訪時間及病例數有限，AQP1對于預后的指示意義有待進一步擴大樣本和深入研究才能得到確切的依據。

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Relationship between AQP-1/MVD and oncosis in gastric carcinoma and its clinical significance

Objective To investigate the relationship of aquaporin-1(AQP1)and microvessel density(MVD)with the oncosis in gastric carcinoma and its clinical significance.MethodsExpression of AQP1 in 55 cases of gastric cancer and 22 cases of normal gastric tissue was examined by immunohistochemical method and Western blot.MVD was examined by immunohistochemical method.Oncosis was observed by transmission electron microscope.Both the expression of AQP1 and MVD were measured by the image analysis．All 55 patients were followed up and the relationship of AQP1 and MVD with patients'survival was analyzed.ResultsOncosis was observed by transmission electron microscopy in tissue specimens of gastric carcinoma. The oncosis index(OI)was decreased with decreasing of clinical staging(P＜0.01)and it was higher in cases with lymph node metastasis than those without(P＜0.05).The expression of AQP1 was positively correlated with MVD(P＜0.05).In gastric cancer tissue,the positive expression rate of AQP1 was 58.2%,significantly higher than that in the normal gastric tissue(P＜0.01).AQP1 was significantly correlated with lymphatic metastasis.Multivariate analysis revealed that AQP1 expression and lymph node metastasis were independent prognostic factors of poor survival(P＜0.05).ConclusionAQP1 may contribute to the progression of gastric cancer by inhabiting oncosis and leading to angiogenesis,and it can be used as an independent prognostic factor for gastric carcinoma．

Gastric cancer AQP-1 Microvesseldensity Oncosis

2013-06-07）

（本文編輯：嚴瑋雯）

溫州市科技局對外合作重大課題（H20080056）；溫州醫科大學附屬第二醫院課題（2013A003）

325027 溫州醫科大學附屬第二醫院胃腸外科

鄭志強，E-mail：fame198288@126.com