宮頸癌及宮頸上皮內瘤變MGMT基因甲基化及其相關性研究

陸歡　陳瑩蓉　孫立奇　陶志梅　張甦　鄧再興　戴利成

宮頸癌及宮頸上皮內瘤變MGMT基因甲基化及其相關性研究

陸歡陳瑩蓉孫立奇陶志梅張甦鄧再興戴利成

【摘要】目的探討宮頸癌和宮頸上皮內瘤變（CIN）患者宮頸脫落細胞中O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶（MGMT）基因啟動子區甲基化狀態在宮頸癌臨床早期診斷和篩查中的作用。方法選取對照組20例，CINI、CINII、CINIII期患者各50例和宮頸癌患者50例，采用甲基化特異性PCR檢測宮頸脫落細胞中MGMT基因啟動子區甲基化狀態并進行比較。結果宮頸癌和CINI、II、III期患者MGMT基因啟動子區甲基化陽性率分別為82.0%（41/50）、24.0%（12/50）、50.0%（25/50）和80.0%（40/50），而對照組未檢測到MGMT基因啟動子區甲基化。與對照組比，宮頸癌組和CINI、II、III期組MGMT基因啟動子區甲基化陽性率的差異均有統計學意義（均P＜0.05）。宮頸癌組中MGMT基因啟動子甲基化與其臨床分期及組織分化程度有顯著相關性（均P＜0.05）。結論MGMT基因啟動子區甲基化可能參與宮頸癌的發生、發展，有助于宮頸癌的早期輔助診斷和篩查。

【關鍵詞】宮頸癌O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶甲基化

宮頸癌目前發病率居女性惡性腫瘤第二位，僅次于乳腺癌，是一種嚴重危害婦女健康的惡性腫瘤。宮頸癌的發展經歷宮頸上皮內瘤變（CIN）期，故檢查宮頸癌癌前病變，并采取有效的治療是阻斷宮頸癌發展的有效方法。O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶(MGMT)基因啟動子甲基化可導致基因表達失活，使一些同腫瘤發生相關的基因表達發生變化而引起腫瘤[1]。有研究表明MGMT基因的甲基化與宮頸癌的發生存在相關性[2]，然而同時檢測宮頸癌和CIN患者MGMT基因甲基化的報道目前鮮見。本研究對宮頸癌和CIN患者宮頸脫落細胞中的MGMT基因啟動子甲基化狀態進行檢測，探討其在宮頸癌發生、發展中的臨床意義，旨在為宮頸癌的早期輔助診斷和篩查提供參考。

1　資料和方法

1.1一般資料選取2007-01—2013-07湖州市婦幼保健院診斷的CIN及宮頸癌患者200例。其中CINⅠ組50例，年齡31～75（47.6±8.6）歲；CINⅡ組50例，年齡29～74（44.3±10.5）歲；CINⅢ組50例，年齡31～70（42.4± 7.5）歲；宮頸癌組50例，年齡30～75（43.5±10.8）歲。所有標本均經病理組織學檢查證實，宮頸癌臨床分期：Ib期18例，Ⅱa期28例，Ⅲa期4例。組織學分級：低分化3例，中分化37例，高分化10例。另擇同院對照組（慢性宮頸炎、子宮肌瘤等無宮頸病變者）20例，年齡27～76（44.9±10.3）歲。各組患者年齡差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究通過醫院倫理委員會審批后進行，患者均簽訂知情同意書。

1.2標本采集采集宮頸脫落細胞，置于5ml宮頸脫落細胞保存液中，取1ml樣本置于1.5ml離心管中，12 000r/ min離心5min，去上清液，再加入500μl的1×TBS，12 000 rpm離心5min，去上清液，沉淀即為收集的細胞，-20℃保存。

1.3主要試劑DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，PCR產物純化試劑盒購自普洛麥格（北京）生物技術有限公司，TakaRa Ex Taq耐熱性DNA聚合酶、Marker為大連寶生物工程有限公司產品。

1.4方法

1.4.1DNA提取嚴格按試劑盒說明書進行，用分光光度儀測定OD260、OD280，計算濃度及OD260/OD280比值，OD260/OD280比值≥1.8的DNA為合格樣本。

1.4.2DNA亞硫酸氫鈉修飾將提取的DNA作亞硫酸氫鈉鹽修飾，于-20℃保存備用。

1.4.3甲基化特異性PCR針對亞硫酸氫鈉處理后CpG位點的改變，由上海生物工程技術服務有限公司合成兩對引物：甲基化引物（5＇-TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC-3＇,5＇-GCACTCTTCCGAAAACGAAACG-3＇），生成片段為83 bp，非甲基化引物（5'-TTTGTGTTTTGATGTTTGTAGGTTTTTGT-3＇,5＇-AACTCCACACTCTTCCAAAAACAAAACA-3＇），生成片段為91 bp，分別用于擴增MGMT基因啟動子區甲基化與非甲基化狀態。甲基化特異性PCR反應條件為：94℃預變性3 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，共40個循環；72℃延伸10 min。反應產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.4.4甲基化分析基因甲基化率=基因甲基化數/總標本數×100%。

1.5統計學處理采用SPSS13.0統計軟件，組間計數資料的比較采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman等級相關分析。

2　結果

2.1MGMT基因啟動子區甲基化狀態MGMT基因啟動子區甲基化狀態檢測結果見圖1；各組MGMT基因啟動子區甲基化陽性率見表1。

由圖1可見，宮頸癌組和CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ組與對照組比較MGMT基因啟動子區甲基化陽性率的差異均有統計學意義（均P＜0.05）；CINⅠ和Ⅱ組與宮頸癌組比差異均有統計學意義（均P＜0.05）。CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ組MGMT基因啟動子區甲基化陽性率逐漸升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1　MGMT基因啟動子區甲基化狀態檢測結果（M：甲基化；U：非甲基化；A：對照組；B：CINⅠ組；C：CINⅡ組；D：CINⅢ組；E：宮頸癌組；Marker：50～100 bp）

表1　各組MGMT基因啟動子區甲基化陽性率比較

2.2不同分期和病理類型宮頸癌MGMT基因啟動子區甲基化與臨床特征的關系

表2　不同分期和病理類型宮頸癌MGMT基因啟動子區甲基化與臨床特征的關系

由表2可見，不同分期的宮頸癌MGMT基因甲基化差異有統計學意義（P＜0.05）；相關性分析表明，臨床分期與MGMT基因甲基化率呈正相關關系（r=0.898，P＜0.05）。不同組織學分化程度的宮頸癌MGMT基因甲基化率有統計學差異（P＜0.05）；相關性分析表明，組織分化程度與MGMT甲基化率呈負相關關系（r=-0.964，P＜0.05）。

3　討論

宮頸癌是全球婦女惡性腫瘤中僅次于乳腺癌的第二位最常見的惡性腫瘤，占所有婦科腫瘤的15%。宮頸癌是唯一可以早期發現的婦科疾病，采用現代醫學手段診斷癌前病變，及時采取措施，即可保證女性重新過上健康生活。因此，尋找早期診斷和篩查宮頸癌的生物標記物意義重大。

基因組DNA抑癌基因的異常甲基化與腫瘤的發生、發展和預后密切相關。研究發現多種基因在宮頸癌的發生、發展中發生了甲基化修飾，且這種表觀遺傳學改變與宮頸病變程度有一定相關性。研究者采用多種方法分析了宮頸脫落細胞、宮頸活檢組織和血漿標本等，提出DNA甲基化可能用于宮頸癌篩查[3-4]。MGMT是人類DNA修復系統中最重要的直接修復酶，在細胞內主要修復DNA的O6-烷基鳥嘌呤的損傷，可保護染色體免受烷化劑的致突變、致癌和細胞毒反應的損傷。MGMT基因和大多數管家基因一樣，啟動子缺少TATA盒和CAAT盒，但一些區域富含GC序列。腫瘤抑制基因和其他一些腫瘤相關基因的啟動子或5＇端內高度甲基化是人類腫瘤的一個共同特點，且常常導致基因轉錄終止和相關蛋白丟失。由于MGMT基因具有這些結構特點，故被認為其啟動子中CpG島的過度甲基化會降低基因的表達，導致該基因轉錄的蛋白表達減少。在2009年相繼發表的3篇關于宮頸癌相關基因甲基化研究的文章中[5-7]，分別報道了不同人群（美國、韓國、希臘）不同的幾組基因，這幾組基因的甲基化改變都與宮頸癌病程的發展有一定的相關性。其中僅MGMT基因為這幾組基因中唯一一個重復出現的基因。提示了該基因的甲基化情況與宮頸癌發生、發展相關具有較強的可靠性。

本研究對宮頸癌和CIN患者宮頸脫落細胞中的MGMT基因啟動子甲基化狀態進行檢測，探討其在宮頸癌發生、發展中的臨床意義，為宮頸癌的早期輔助診斷和篩查提供更有效的方法。本研究結果顯示，甲基化MGMT只在宮頸癌和CIN患者中有表達，50例宮頸癌患者中，甲基化率達82%。而正常對照組中未檢測到MGMT基因啟動子區甲基化，這提示MGMT基因啟動子區的甲基化在宮頸癌的發生過程中發揮著一定作用。宮頸癌的發展是從宮頸不典型增生到宮頸原位癌再到宮頸浸潤癌的漸進過程，其中有一個間隔較長的并可逆轉的癌前病變時期-CIN期。CIN分為CINⅠ、CINⅡ和CINⅢ，各級CIN均有發展為浸潤癌的趨勢，級別越高發展為浸潤癌的機會越多，級別越低，自然退縮的機會越多。研究表明，宮頸浸潤癌5年存活率為67%，CIN為 100%[8]。本研究結果提示CIN作為宮頸癌的癌前病變階段，其MGMT基因啟動子區甲基化陽性率隨級別的升高而呈遞增趨勢，所以MGMT基因甲基化檢測作為一種新的分子生物學指標可能為宮頸癌的早期輔助診斷和篩查提供了更有效的方法。本研究還發現，宮頸癌組中MGMT基因啟動子甲基化與其臨床分期及組織分化程度有顯著相關性。表現為隨著臨床分期的增加，MGMT甲基化率也隨之升高；腫瘤惡性程度越高，分化程度越低，MGMT甲基化狀態也越普遍。

綜上所述，MGMT基因啟動子區甲基化與宮頸癌之間存在著密切聯系。同時，研究也提示，MGMT基因啟動區高甲基化是宮頸癌發生、發展的早期事件，可作為新的腫瘤標記物，有助于宮頸癌的早期輔助診斷和治療。

4　參考文獻

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（本文編輯：沈昱平）

收稿日期：（2014-08-22）

基金項目：湖州市科技局自然資金課題（2010YZ02）

作者單位：313000湖州市婦幼保健院婦產科（陸歡、孫立奇、陶志梅、張甦），病理科（鄧再興）；湖州市中心醫院中心實驗室（陳瑩蓉、戴利成）

通信作者：戴利成，E-mail：dlc21@126.com

Relationship between methylation of MGMT gene promoter and cervical carcinoma

【Abstract】ObjectiveTo investigate the methylation status of MGMT gene promoter in cervical carcinoma and cervical intraepithelial neoplasia(CIN).MethodsMethylation status of MGMT gene promoter was detected with methylation specific PCR (MSP)in cervical exfoliated cells from patients with CINI(n=50),CINII(n=50),CINIII(n=50),cervical carcinoma(n=50)and non-cancer controls(n=20).ResultsThe promoter methylation rates of MGMT were 82.0%(41/50),24.0%(12/50),50.0%(25/50) and 80.0%(40/50)in cervical carcinoma,CIN I,CINII and CINIII,while no methylation was detected in control group(P＜0.05). The methylation of MGMT gene was correlated with the clinicopathological characteristics and tissue differentiation of cervical carcinoma(P＜0.05).ConclusionThe methylation of MGMT gene promoter region is associated with cervical carcinoma,which may be used as potential marker for early diagnosis of cervical carcinoma.

【Key words】Cervical carcinomaMGMTMethylation