RP-HPLC法測定食用動物油脂中苯甲酸與山梨酸的含量

符傳武，覃子龍

（廣西柳州食品藥品檢驗所，廣西 柳州 545006）

目前，苯甲酸和山梨酸在我國廣泛用作各種食品的防腐劑，有資料表明，其能引起人的再生障礙性貧血，粒狀白細胞缺乏[1]。因此，國家嚴格限制其使用量。對食用動物油脂中的苯甲酸、山梨酸含量進行測定，從而對其進行有效監控，不僅關系到消費者的食用安全，還涉及到相關企業的經濟效益和市場空間，促進相關產業健康發展。對食品中山梨酸、苯甲酸含量測定的方法主要有氣相法[2-6]、液相法[2，7-20]、薄層色譜法[2]和毛細管區帶電泳法[21]，但由于食用動物油脂的基體較為特殊，現有的檢測方法不能有效控制該樣品中苯甲酸、山梨酸的含量。本實驗參照了GB/T5009.29—2003《食品中山梨酸、苯甲酸的測定》及GB/T23495—2009《食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》，摸索了食用動物油脂的樣品前處理方法。對同時測定食用動物油脂中苯甲酸、山梨酸的含量提出了可靠的方法。此項目在食用動物油脂中的檢測目前未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苯甲酸對照品（批號：100419-200301）：購于中國藥品生物制品檢定所；山梨酸對照品（批號：BW3507-08002）：購于中國計量科學研究所。豬油（檢驗編號：SP20130215、SP20130177、SP20130338、SP20130474、SP20130465、SP20130396、SP20130419、SP20130494、SP20130521、SP20130543）；牛油（檢驗編號：SP20130119、SP20130425、SP20130374、SP20130382、SP20130285、SP20130508、SP20130545）分別為柳州、來賓市食品藥品監督管理局委托檢驗樣品；甲醇為一級色譜純（純度99.9%）：天津四友生物醫學技術有限公司；水為Ⅰ級純化水；其余試劑均為分析純。

磷酸鹽緩沖溶液（pH7.2）：稱取16.72g磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）和2.72g磷酸二氫鉀（KH2PO4），用水溶解后定容至1000mL，即得。

1.2 儀器與設備

Waters1525高效液相色譜儀、紫外檢測器：美國Waters公司；AE200型電子分析天平：Mettler Toledo公司；元素820a型摩爾實驗室超純水器：上海摩勒生物技術有限公司；VDRTEX-5旋渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；LDZ4-1.2型低速自動平衡微型離心機：北京醫用離心機廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件

色譜條件：Wondasil-C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；以甲醇-0.02mol/L乙酸銨溶液（5∶95）為流動相，檢測波長為230nm；流速為1.0mL/min；柱溫為35℃；進樣量為10μL。

1.3.2 溶液的制備

對照品溶液：分別精密稱取苯甲酸、山梨酸對照溶液適量，加磷酸鹽緩沖溶液配制成每1mL含苯甲酸、山梨酸為1 000μg的混合溶液作為對照品儲備液，再精密量取0.1mL，置于10mL客量瓶中，加磷酸鹽緩沖溶液稀釋至刻度作為對照品溶液。

供試品溶液：精密稱取樣品約2g于50mL具塞離心管中，加入10mL磷酸鹽緩沖液，用旋渦混合器充分混合，然后4 000r/min離心5min，小心吸出水層轉移到25mL容量瓶中，再加入10mL磷酸鹽緩沖液于具塞離心管中，重復上述步驟，合并兩次水層液，用磷酸鹽緩沖液定容至刻度，混勻，用0.45μm濾膜濾過作為供試品溶液。

陰性樣品溶液：稱取動物油脂（豬油），按照供試品溶液的制備方法，制成苯甲酸、山梨酸的陰性樣品溶液。

2 結果與討論

2.1 系統適用性實驗及專屬性考察

在上述色譜條件下分別取對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。理論塔板數均在3 000以上，分離度大于1.5。苯甲酸保留時間約為10min，山梨酸保留時間約為14min（見圖1），樣品與陰性樣品之間無干擾。

2.2 線性關系

分別精密量取“1.3.2”項下的苯甲酸和山梨酸的混合對照品儲備液適量，用磷酸鹽緩沖液稀釋，制備成含苯甲酸和山梨酸均為0、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL、320μg/mL的對照品溶液。分別精密量取10μL，注入液相色譜儀，記錄圖譜，以苯甲酸和山梨酸的峰面積（A），分別對其濃度（C，μg/mL）進行線性回歸。結果回歸方程和相關系數分別為：

表明兩者的色譜峰面積與質量濃度在0～320μg/mL范圍內均有良好的線性。

圖1 陰性對照（A）、樣品（B）、苯甲酸和山梨酸混合對照品（C）色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of negative control (A),sample (B)and sorbic acid reference substances (C)

2.3 精密度實驗

分別精密量取“1.3.2”項下的苯甲酸和山梨酸的對照品溶液10μL注入液相色譜儀，按上述的色譜條件進行分析，測定其峰面積9次，苯甲酸和山梨酸的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別為0.53%和0.26%。

2.4 回收實驗

精密稱取已知樣品6份，每份約2g，分別加入苯甲酸和山梨酸對照品適量，照“1.3.2”項下供試品溶液配制的方法配制低、中、高3種質量濃度的溶液，并按上述色譜條件下進行測定，計算回收率及RSD，結果見表1。

2.5 重復性實驗

按“2.4”項下的的方法制備5份中質量濃度的加標供試品溶液，在上述色譜條件下進行測定，測得苯甲酸和山梨酸含量的平均值分別為0.98mg/g和0.98mg/g；RSD分別為0.88%和0.71%。

表1 回收率測定結果（n=3）Table 1 Determination results of recovery rate

2.6 穩定性實驗

取“2.5”項下其中的一份加標供試品溶液在室溫條件下放置，在0、3、6、12、24h測定，記錄主峰面積，結果表明，峰面積無明顯變化，苯甲酸和山梨酸的RSD分別為0.58%、0.43%。

2.7 最低方法檢測限

在選定的色譜條件下，取“2.4”項下的低質量濃度的供試品溶液，當信噪比為2時計算其最低方法檢測限，結果表明，苯甲酸的最低方法檢測限為0.05mg/kg；山梨酸的最低方法檢測限為0.05mg/kg。

2.8 樣品測定

精密稱取17批次的樣品，按“1.3.2”項下的方法制備樣品溶液；另取“1.3.2”項下的對照品溶液。按上述各自色譜條件，分別注入液相色譜儀10μL，記錄色譜圖。按外標法以峰面積計算出苯甲酸和山梨酸的含量。其中10批次的豬油（檢驗編號：SP20130215、SP20130177、SP20130338、

SP20130474、SP20130465、SP20130396、SP20130419、SP20130494、SP20130521、SP20130543）樣品均未檢出苯甲酸和山梨酸；7批次的牛油（檢驗編號：SP20130119、

SP20130425、SP20130374、SP20130382、SP20130285、SP20130508、SP20130545）樣品中，檢驗編號為SP20130374的樣品檢出苯甲酸，其含量為9.7mg/kg；檢驗編號為SP20130425檢出山梨酸，其含量為304.2mg/kg；其他批次的牛油樣品中均未檢出苯甲酸和山梨酸。

3 討論

3.1 目前測定苯甲酸和山梨酸國家標準有GB/T5009.29—2003《食品中山梨酸、苯甲酸的測定》及GB/T23495—2009《食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》。食用動物油脂的基體較為特殊，GB/T5009.29—2003檢驗標準中樣品前處理的方法不能滿足測定要求；若完全按GB/T23495—2009測定食用動物油中的苯甲酸和山梨酸，則會出現假陰性。故建立本標準來控制食用動物油脂中苯甲酸和山梨酸的含量，以便更好的對食用動物油脂中防腐劑的監測。

3.2 對使用GB/T23495—2009方法測定食用動物油中的苯甲酸和山梨酸出現假陰性的原因進行研究，發現其出現假陰性是由于對照品及樣品的制備的過程中所用溶劑不一致造成，建議使用GB/T23495—2009的方法測定含油脂較高的樣品時，其對照品溶液的配制使用和樣品一樣的溶劑。

3.3 建議測定食用動物油脂中的苯甲酸和山梨酸含量時，使用固體對照品。若使用其對照水溶液，則對照水溶液中的溶劑量會改變對照品配制中所用磷酸鹽緩沖液的pH值，造成對照品峰與樣品峰不一致，但經實驗發現，若其對照水溶液的含量與磷酸鹽緩沖液的比值控制在1%以內時，則對測定無影響。

3.4 從樣品測定的數據推測，由于火鍋店需要大量的牛油和羊油，可能會造成不法企業違法向牛油和羊油中添加防腐劑，以便防止油脂的腐化。建議監管部門加大對火鍋店中食用動物油脂特別是牛油及羊油的監管力度，同時建議國家盡快出臺食用動物油脂防腐劑的使用標準，促進食用動物油脂加工產業健康穩定發展。

3.5 由于本次實驗使用的流動相水相占有的比例很大，建議選用親水性強的色譜柱進行實驗，否則會影響苯甲酸和山梨酸之間的分離度且容易損壞色譜柱。在長時間進樣過程中，有可能會出現苯甲酸和山梨酸之間的分離度會越來越小，甚至無法分離的情況出現，這是由于大量的水相使色譜柱的親水性能變弱引起的，只要用有機相（甲醇）把水相完全置換出來就又能獲得較好的分離效果。

4 結論

采用反相高效液相色譜法，以Wondasil C18（4.6mm×250mm，5μm）為色譜柱，甲醇-0.02mol/L乙酸銨溶液（5∶95）為流動相，檢測波長為230nm，柱溫為30℃，流速為1.0mL/min，進樣量10μL，測定食用動物油脂中苯甲酸與山梨酸的含量，回收率和精密度令人滿意，方法準確度、靈敏度好、方法檢測限較低，完全滿足食用動物油脂中苯甲酸與山梨酸的檢測需要，同時也為含油脂類較高的食品中苯甲酸與山梨酸的檢測提供了參考。

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