一種方便筷子細菌菌落總數檢測方法研究

孫夢桐，臧藝平，繆璐歡，杜靜芳，呂欣然，白鳳翎*

（渤海大學 化學化工與食品安全學院，遼寧省食品安全重點實驗室“食品貯藏加工及質量安全控制工程技術研究中心”遼寧省高校重大科技平臺，遼寧 錦州 121013）

隨著生活節奏的加快，一次性產品大量進入人們的日常生活，其中一次性方便筷子是餐飲業使用最普遍的產品[1]。由于生產廠家的參差不齊，方便筷子的微生物污染問題比較突出[2-5]。一般應用于餐具表面檢測細菌數量的方法為傳統的棉拭子法，表面微生物的檢測方法與分離微生物的難易程度有關，同時還取決于表面的結構及微生物的種類和性質[6-7]。研究發現，棉拭子法非常適用于柔軟、粗糙及污染嚴重的表面[8]。此外，應用于表面細菌數量的測定方法還有接觸平板法、瓊脂注射法、黏性薄膜法、噴霧槍法等[9-13]。這些方法主要是應用培養介質或載體方式獲取表面微生物，經定量稀釋后，應用標準培養基進行計數。MOSSEL D A等[14]在檢測木質表面微生物時，研究發現黏性薄膜法比棉拭子法效果差。

本研究以一次性方便筷子為研究對象，針對其表面比較堅硬、光滑和形狀不規則的特點，采用直接振蕩法與傳統棉拭子法進行分析比較，探討一種更適合檢驗不規則形狀餐具表面的細菌菌落總數的檢驗方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 標準菌株

埃希氏大腸桿菌（Escherichia coliCMCC44102）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimuniunsCMCC50115）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureusCMCC26003）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformisACCC11091）：渤海大學食品科學研究院保藏。

1.1.2 培養基

平板計數瓊脂培養基和LB培養基：北京奧博星生物技術有限公司。方便筷子：錦州市大潤發超市。

1.2 儀器與設備

LRH系列生化培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；MLS-3030CH型立式高壓蒸汽滅菌器：SANYO電機（廣州）有限公司；IKA Vortex GENIUS3振蕩器：德國IKA公司。

1.3 方法

將埃希氏大腸桿菌、傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和地衣芽孢桿菌接種于LB液體培養基，置于37 ℃培養20 h，用無菌0.85%生理鹽水稀釋至菌濃度約為106CFU/mL。將一次性方便筷子一分為二后，用手術刀平均切為3段，121 ℃滅菌15 min。將無菌筷子浸泡在約106CFU/mL 4種試驗菌株的菌液中，浸泡30 min后無菌條件下晾干，備用。

1.3.1 棉拭子法

用無菌棉拭子擦拭菌液浸泡后方便筷子的表面，每節筷子用3支棉拭子，反復擦拭3次，擦拭后置于9 mL滅菌生理鹽水中，在IKA Vortex GENIUS3振蕩器以2 000 r/min分別振蕩4 min、8 min、12 min和16 min，振蕩液進行10倍梯度稀釋，選擇10-3、10-4和10-5三個稀釋度，按GB 4789.2—2012《食品微生物學檢驗大腸埃希氏菌計數》進行細菌菌落總數測定[15]。

1.3.2 振蕩法

將菌液浸泡后的方便筷子直接置于10 mL滅菌生理鹽水中，在IKA Vortex GENIUS3振蕩器以2 000 r/min分別振蕩4 min、8 min、12 min和16 min，振蕩液進行10倍梯度稀釋，選擇10-3、10-4和10-5三個稀釋度，按GB 4789.2—2012進行細菌菌落總數測定[10]。

1.3.3 數據統計分析

采用SPSS19軟件對實驗數據進行方差分析。當P＜0.05時，表示差異顯著，當P＞0.05時，表示差異不顯著，所有實驗重復3次。

2 結果與討論

應用振蕩法和棉拭子法測定單支方便筷子表面埃希氏大腸桿菌菌落總數如圖1所示，由圖1可以看出，振蕩法的檢測結果明顯高于棉拭子法，在8 min時振蕩法與棉拭子法比值為1.25，達到最高值。經統計學分析，在4 min、8 min、12 min和16 min兩種方法具有顯著差異（P=0.013＜0.05）。

圖1 方便筷子表面埃希氏大腸桿菌菌落總數測定結果Fig.1 Results of APC of E.coli on convenient chopsticks surface

圖2是傷寒沙門氏菌菌液浸泡后的單支方便筷子表面經振蕩法和棉拭子法測定的細菌菌落總數結果，從圖2可以得出，振蕩法明顯高于棉拭子法（P=0.022＜0.05）。從振蕩法與棉拭子法兩者的比值來看，在4 min時最高，到8 min時變化趨勢變緩。

圖2 方便筷子表面傷寒沙門氏菌菌落總數測定結果Fig.2 Results of APC of S.typhimuniuns on convenient chopsticks surface

對革蘭氏陽性的金黃色葡萄球菌和地衣芽孢桿菌而言，從圖3和圖4可以看出，從4 min起始至12 min結束，其振蕩法和棉拭子法兩者的比值呈現先抑后揚的走勢。就振蕩法與棉拭子法的檢測結果對比而言，振蕩法明顯高于棉拭子法，P值分別為0.002和0.006，兩者具有顯著差異。

圖3 方便筷子表面金黃色葡萄球菌菌落總數測定結果Fig.3 Results of APC of S.aureus on convenient chopsticks surface

圖4 方便筷子表面地衣芽孢桿菌菌落總數測定結果Fig.4 Results of APC of B.licheniformi s on convenient chopsticks surface

表1 振蕩法與棉拭子法數據的成對樣本t 檢驗Table 1 Paired samples test of oscillametric method and cotton swab method data

綜合4種供試菌株的兩種檢測方法的比值，振蕩法明顯高出傳統棉拭子法。且在4 min時達到最大值，因此選擇4 min為振蕩時間。

3 結論

應用振蕩法檢測筷子細菌菌落總數，與傳統的棉拭子法進行比較，振蕩法檢測4種細菌的測定結果平均高出棉拭子法20%以上，兩者具有顯著性差異。在4 min時振蕩法能檢測數量多的細菌，所以最佳振蕩時間為4 min。

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[15]中華人民共和國衛生部.GB 4789.2—2010 食品微生物學檢驗菌落總數測定[S].北京：中國標準出版社，2010.