基于Biolog ECO技術分離窖泥細菌的研究

湯有宏，吳文睿

（安徽古井貢酒股份有限公司，安徽 亳州 236820）

Biolog ECO技術是通過微生物對碳源的利用能力來表征微生物群落代謝多樣性和功能多樣性，即利用微生物對不同碳源代謝率的差異，通過檢測微生物細胞利用不同碳源進行新陳代謝過程中產生的氧化還原酶與顯色物質發生反應而導致的顏色變化，與標準數據庫進行比對，即可得出最終鑒定結果。該法最初應用于純種微生物鑒定，1991年開始應用于土壤微生物群落的研究。

窖泥微生物的生長、繁殖是以窖池和酒醅為基礎，進行復雜的物質能量代謝過程，而濃香型白酒的品質與窖池微生物的代謝有著重要聯系，對于老窖泥中功能微生物的研究一直都是濃香型白酒的一個重要科目；窖泥中微生物的研究目前主要包括窖泥中微生物種群及其變化規律研究、窖泥中功能微生物的研究及應用，窖泥中微生物種群的分離和鑒定，以及微生物代謝模式的初步構建。我國也從20 世紀60 年代開始對濃香型大曲酒與窖泥微生物的關系進行了研究，發現老窖泥中富集有多種厭氧功能菌、嫌氣性梭狀芽孢桿菌；20世紀80年代以來，中科院成都生物所對瀘州老窖進行了深入的研究，從濃香型酒老窖中分離出一株產甲烷桿菌，開發出甲烷細菌與己酸菌共酵的二元發酵技術；對從瀘州老窖泥中分離的微生物種群進行了分離和鑒定的研究。目前不少科研機構、院校和白酒廠完成了窖泥微生物研究項目，對各廠的窖泥微生物中功能菌進行較深入研究，對指導生產和推動釀酒技術進步起了很重要作用。由于各酒廠所處地理位置、氣候環境和微生物群系不同，其窖泥微生物不盡相同。系統性研究古井貢酒窖泥微生物中功能菌以及古井貢酒窖泥微生物中特色菌株十分必要。

通過摸擬窖池微生物的微生態環境、針對窖池微生物的生長特點，利用不同的培養基，運用現代生物技術對古井窖泥微生物進行分離、鑒定及功能性的研究，了解窖泥功能菌的菌種特性、生長條件、作用機理；研究該項目解決釀酒生產過程中窖泥老化、失去活性，提高人工窖泥質量；探索窖泥微生物在白酒發酵中的作用機理，尋找古井貢酒特色功能菌。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

窖泥：安徽古井貢酒股份有限公司50年老窖泥。

1.1.2 培養基（質量百分數計）

液體富集培養基：蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、葡萄糖3%、氯化鈉0.05%、硫酸銨0.09%、硫酸鐵0.01%、硫酸鎂0.03%、酒醅浸提液、碳酸鈣2%，pH 7.0，在121 ℃條件下滅菌20 min。

分離培養基：蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、葡萄糖3%、氯化鈉0.05%、硫酸銨0.09%、硫酸鐵0.01%、硫酸鎂0.03%、GaCl20.5%、酒醅浸提液、瓊脂2%，pH 7.0，在121 ℃條件下滅菌20 min。

酒醅浸提液分離培養基：酒醅浸提液、GaCl20.5%、瓊脂2.0%、葡萄糖1.0%、pH 6.5～7.0，在121 ℃條件下滅菌15 min。

富集培養基：NaAc 0.5%、酵母膏0.15%、MgSO4·7H2O 0.02%、K2HPO40.04%、（NH4）2SO40.05%、CaCO31%，酒醅浸提液，乙醇2.0%（滅菌后使用前加入），自然pH；0.12 MPa高壓蒸汽滅菌20 min。固體培養基加入2.0%的瓊脂。

分離培養基：NaAc 0.5%、酵母膏0.15%、MgSO4·7H2O 0.02%、K2HPO40.04%、（NH4）2SO40.05%、GaCl20.5%，酒醅浸提液，乙醇2.0%（滅菌后使用前加入），自然pH；0.12 MPa高壓蒸汽滅菌20 min。固體培養基加入2.0%的瓊脂。

出窖糟浸提液分離培養基：酒醅浸提液、GaCl20.5%、瓊脂2.0%、乙醇2.0%（滅菌后使用前加入），pH 6.5～7.0。

Biolog鑒定板與培養基：美國Biolog公司。

1.2 儀器與設備

Biolog微生物鑒定系統：美國Biolog公司；Forma 3100直熱式二氧化碳培養箱，厭氧工作站，2.5 L、5 L厭氧發酵罐：美國Thermo Scientific公司；DMI3000顯微鏡、DMI6000顯微鏡：德國BLeica公司。

1.3 實驗方法

窖泥中的微生物以細菌為主，通過摸擬窖池微生物的微生態環境、針對窖池微生物的生長特點，利用不同的培養基，運用現代生物技術對古井窖泥微生物進行分離。針對窖泥中的微生物特點從二方面對窖泥功能菌進行分離、純化。

1.3.1 以糖為碳源的窖泥中的微生物的分離、鑒定

取10 g老窖泥85 ℃加熱處理10 min，冷卻后加入富集培養基培養35 ℃培養5～7 d，另取10 g不進行加熱處理的老窖泥加入富集培養基35 ℃條件下培養5～7 d，分別選取產氣泡好的富集培養液經適當稀釋，在不同的分離培養基進行涂布，分別在二氧化碳含量0、5%、10%，溫度30 ℃、35 ℃進行好氧培養及厭氧培養。

富集培養液在30 ℃存放1～2月后，取富集培養液經適當稀釋，在不同的分離培養基進行涂布，分別在二氧化碳含量0、5%、10%，溫度30 ℃、35 ℃進行好氧培養及厭氧培養。

挑選上述方法進行培養平板上的單個菌落，進行純化培養，待鑒定。

篩選菌株經過特定培養基1～2次純化培養，經Biolog微生物鑒定儀鑒定，確定窖泥微生物菌株。

1.3.2 以非淀粉糖為碳源的窖泥中的微生物的分離、鑒定

取10 g老窖泥85 ℃加熱處理10 min，冷卻后加入富集培養基培養30～35 ℃培養7 d，另取不進行加10 g熱處理的老窖泥加入富集培養基35 ℃條件下培養5～7 d，分別選取產氣泡好的富集培養液經適當稀釋，在不同的分離培養基進行涂布，分別在二氧化碳含量0、5%、10%，溫度30 ℃、35 ℃進行好氧培養及厭氧培養。

富集培養液在30 ℃存放1～2月后，取富集培養液經適當稀釋，在不同的分離培養基進行涂布，分別在二氧化碳含量0、5%、10%，溫度30 ℃、35 ℃進行好氧培養及厭氧培養。

挑選上述方法進行培養平板上的單個菌落，進行純化培養，待鑒定。

篩選菌株經過特定培養基1～2次純化培養，經Biolog微生物鑒定儀鑒定，確定窖泥微生物菌株。

1.3.3 Biolog微生物鑒定儀鑒定

利用微生物對不同碳源進行呼吸代謝的差異，針對每一類的微生物篩選95種不同的碳源或其他生物和化學物質，配合四唑類顯色物質固定于96孔鑒定板上（A1孔為陰性對照），鑒定板底物不僅包含71種碳源，還增加了23種化學物靈敏性，接種菌懸液后培養一定時間，通過檢測微生物細胞利用不同碳源進行呼吸代謝過程產生的氧化還原物質與顯色物質發生反應而導致顏色的變化（吸光度值表示）以及由于微生物生長造成和的濁度差異，生成特征指紋圖譜與標準菌株圖譜數據庫進行比對，即可得出最終鑒定結果。Biolog微生物鑒定儀鑒定方法屬于的生理生化等表型測定鑒定方法，表型鑒定和基因型鑒定屬兩個不同的方法，對應兩種不同的分類學，兩者應互為補充。基因決定蛋白，進而決定表型，表型鑒定更為經典，對實際的研究和生產更具有價值。

鑒定步驟為：用Biolog專用培養基將純種擴大培養；按要求配制一定濁度（細胞濃度）的菌懸液；將菌懸液接種至微孔鑒定板（Microplate），培養一定時間；將培養后的鑒定板放入讀數儀中讀數，軟件自動給出鑒定結果。

2 結果與分析

通過上述方法完成兩類菌120多株菌的純化分離，通過微生物鑒定儀鑒定后，已鑒定確定80多株菌株，具體如表1所示。

目前從分離的、已鑒定87株菌株，大部分屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）、芽孢乳桿菌屬（Lactobacillus）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、諾卡氏菌屬（Nocardia）、梭菌屬（Clostridium）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、鏈球菌屬（Streptococcus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）。其中以芽孢桿菌Bacillus為絕對優勢菌（21株），諾卡氏菌屬Nocardia（8株）、其他桿菌（7株）、梭菌屬Clostridium（7株）、芽孢乳桿菌屬Lactobacillus（5株）、類芽孢桿菌屬Paenibacillus（6株）、鏈球菌屬Streptococcus（4株）、葡萄球菌屬Staphylococcus（4株）、其他球菌（7株）、假單胞菌Pseudomonas（3株）、棒桿菌屬Corynebacterium（3株）、雙歧桿菌Bifidobacterium（3株）為次優勢菌，其余各屬菌株均在3株以下。

表1 古井貢酒窖泥中分離出的可培養細菌及特性Table 1 Characteristics of culturable bacteria which separated from Gujing pit mud

續表

這些微生物對白酒釀造的過程都起著重要的作用，是濃香型大曲酒釀造不可缺少的微生物。與國內的窖泥研究相比較，此次從窖泥中分離篩選的微生物與國內的研究者也有著相似和不同的地方。從查詢資料情況看，用經典方法分離、鑒定得到的窖泥微生物的菌種數量較少，本項目分離、鑒定得到的窖泥微生物的菌種數量是目前比較系統、全面的。目前許多單位用分子鑒定法（16S rDNA）鑒定窖泥微生物，該方法快速、全面、準確，但不能得到單個純的菌種，不便繼續對菌種的生理生化特征進行研究。

對于研究結果的差異性，一方面可能和釀酒酒廠的地理環境、釀酒工藝有關，另一方面也可能和分離方法局限性有著有一定的關系。

3 結論

濃香型白酒的生產以泥窖窖池為基礎，發酵過程是棲息在窖池糟醅、窖泥中的龐大微生物群落在糟醅固、液、氣三相界面進行著復雜的物質能量代謝過程。窖泥中長期馴化的微生物種群及其代謝產物又不斷地進入糟醅中，各種菌的不同代謝產物相互制約、相互協調、相互作用才能形成酒的獨特風味。目前分離的窖泥微生物的菌種許多是濃香型白酒重要功能性微生物，如以短小芽孢桿菌、耐硼賴氨酸芽孢桿菌、栗褐芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌為主的芽孢桿菌類，這類菌與白酒風味物質的產生有很大的關系；如乳桿菌屬、德氏乳桿菌乳酸亞種、戊糖乳桿菌、植物乳桿菌、檸檬明串珠菌、腸膜明串珠菌乳脂亞種、短雙歧桿菌、最小雙歧桿菌、大雙歧桿菌都是益生菌；有的菌株產酸、產酶能力強如梭菌屬，如乳桿菌屬、植物乳桿菌、戊糖乳桿菌德氏乳桿菌乳酸、凝結芽袍桿菌、嗜熱脂肪芽袍桿菌產L-乳酸能力強。有的菌株產酶能力強，如解淀粉芽孢桿產淀粉酶、蛋白酶和DNA酶，煙草節桿菌能夠兼產淀粉酶和蛋白酶。地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌的一些菌株產淀粉酶的活性較高，蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌產蛋白酶，產氣腸桿菌產甘油脫氫酶。

目前正在對已分離、鑒定的窖泥微生物菌種進行菌種生理生化特性、發酵作用機理研究，探索窖泥微生物在白酒發酵中的作用機理，尋找古井貢酒窖泥特色功能菌。

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