響應曲面法優化浸提新疆紅樹莓中花色苷的工藝研究

陳其鋼，沈艾彬，陳國輝*

（新疆中亞食品研發中心（有限公司），新疆 烏魯木齊 830026）

紅樹莓（Rubus idaeus）是薔薇科懸鉤子屬植物，多年生小灌木漿果類果樹，樹莓果屬聚合果，形狀如寶石，果實鮮嫩多汁，口味酸甜，香味濃，可食率達100%[1]。其營養豐富，維生素A達130 IU，是蘋果的13倍[2]；維生素C含量為26～40 mg/100 g，是蘋果、葡萄等果實的5～8倍[3]；還含有多種氨基酸、微量元素、花色苷、花青素以及兒茶酸等多酚類物質[4]，紅樹莓鮮果的營養成分見表1[5-8]。

新疆地處大陸中緯度，氣候溫和，熱量適中，空氣濕潤，得天獨厚的山地氣候適宜樹莓的生長[9]。紅樹莓中富含豐富的花色苷，是其主要的呈色物質，隨著人類對健康飲食的重視以及科技的發展，對天然色素的需求量將日趨增加，劉建華等[10]研究表明，紅樹莓花色苷具有較強的清除自由基、抗腫瘤及降脂等多項功能。本研究以新疆南山水溪溝產紅樹莓為原料提取花色苷，在單因素研究的基礎上，采用Design Expert 8.0軟件優化提取工藝，為新疆樹莓中花色苷的安全有效生產提供理論和技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮紅樹莓：新疆烏魯木齊市南山水溪溝新康種植基地。

鹽酸、質量分數30%的雙氧水、抗壞血酸、體積分數95%的乙醇、乙酸、三氯乙酸：天津市科密歐化學試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

AB104-N電子天平：Mettle-Toledo公司；UV-2000紫外分光光度計：安捷倫科技有限公司；RE-52B旋轉蒸發儀：上海皖寧精密科學儀器有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計：上海森信實驗儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樹莓花色苷的提取工藝流程

紅樹莓→研磨→水浴提取→過濾→真空濃縮→冷凍干燥→紅樹莓花色苷粗提取物

操作要點：新鮮紅樹莓在組織搗碎機破碎成漿，按一定料液比加入經鹽酸酸化的體積分數80%的乙醇溶液，在一定溫度的水浴中提取紅樹莓中花色苷，浸提液經過40 ℃真空濃縮后，于-18 ℃條件下冷凍干燥，得到紅樹莓中花色苷粗提物。

1.3.2 樹莓花色苷含量的檢測方法

波長的確定：將解凍后的紅樹莓研磨，準確稱量5.0 g勻漿，加入40 mL經鹽酸酸化體積分數80%的乙醇溶液（pH 3），50 ℃水浴浸提1 h，過濾去除濾渣。在波長400～800 nm范圍內掃描，確定樹莓花色苷最大吸收波長。

花色苷含量的計算根據比爾定律，結合FULEKI T等[11]的研究，得出花色苷含量計算公式：

式中：A0、A1分別為pH 1.0、pH 4.5時花色苷在波長500 nm 處的吸光度值；V為提取液總體積，mL；n為稀釋倍數；M為矢車菊色素-3-葡萄糖苷的相對分子質量449；ε為Cy-3-Glu 的消光系數29 600；m為樣品質量，g。

1.3.3 提取樹莓花色苷的單因素試驗

料液比對樹莓花色苷提取量的影響：將解凍后的紅樹莓研磨，準確稱量5.0 g勻漿，分別按1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10（g∶mL）加入經鹽酸酸化的體積分數80%的乙醇溶液（pH 3），50 ℃水浴浸提1 h，過濾去除濾渣。波長500 nm處測其吸光度值，計算花色苷含量。

水浴溫度對樹莓花色苷提取量的影響：將解凍后的紅樹莓研磨，準確稱量5.0 g勻漿，加入35 mL經鹽酸酸化的體積分數80%的乙醇溶液（pH 3），分別在40～60 ℃恒溫水浴浸提1 h，過濾去除濾渣。波長500 nm處測其吸光度值，計算花色苷含量。

浸提時間對樹莓花色苷提取量的影響：將解凍后的紅樹莓研磨，準確稱量5.0 g勻漿，加入35 mL經鹽酸酸化的體積分數80%的乙醇溶液（pH 3），50 ℃水浴分別浸提30 min、45 min、60 min、75 min、90 min、105 min、120 min過濾去除濾渣。波長500 nm處測其吸光度值，計算花色苷含量。

1.3.4 響應面優化試驗

以通過單因素試驗確定響應面優化試驗的各因素水平，花色苷提取量（Y）為響應值，試驗設計見表2。

2 結果與分析

2.1 最大吸收波長的測定

根據1.3.2的試驗方法得到樹莓花色苷吸收波長，結果見圖1。

圖1 紅樹莓花色苷吸收圖譜Fig.1 The anthocyanins absorption spectrum of red raspberry

由圖1可知，紅樹莓花色苷的最大吸收波長為500 nm，因此在后續試驗中，采用在波長500 nm處的吸光度值作為計算依據。

2.2 單因素試驗結果與分析

2.2.1 料液比對樹莓花色苷提取量的影響

紅樹莓樣品5.0 g，提取過程中控制體系溫度50 ℃、提取時間60 min，分別按1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10（g∶mL）料液比加入經鹽酸酸化的體積分數80%的乙醇溶液（pH 3），料液比對花色苷含量的影響結果見圖2。由圖2可見，料液比在1∶5～1∶7（g∶mL）范圍內時，隨著料液比的增加，花色苷含量也隨之增加；料液比＞1∶7（g∶mL）時，花色苷含量開始減少。因此，確定提取紅樹莓花色苷的最佳料液比為1∶7（g∶mL）。

圖2 料液比對花色苷含量的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on anthocyanins content

2.2.2 水浴溫度對樹莓花色苷提取量的影響

紅樹莓樣品5.0 g，按料液比1∶7（g∶mL）加入經鹽酸酸化的體積分數80%的乙醇溶液（pH 3），提取時間60 min，分別選擇提取溫度40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃水浴提取，提取溫度對花色苷含量的影響結果見圖3。由圖3可見，隨著提取溫度的升高，體系中的花色苷含量并不是持續升高的趨勢，當溫度達到50 ℃時，花色苷含量達到峰值隨后又開始下降，為了避免樹莓中花色苷因溫度過高而分解，所以選擇提取溫度50 ℃為宜。

圖3 提取溫度對花色苷含量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on anthocyanins content

2.2.3 浸提時間對樹莓花色苷提取量的影響

紅樹莓樣品5.0 g，按料液比1∶7（g∶mL）加入經鹽酸酸化的體積分數80%的乙醇溶液（pH 3），提取溫度50 ℃，設置提取時間分別為30 min、45 min、60 min、75 min、90 min、105 min、120 min。提取時間對花色苷含量的影響結果見圖5。由圖4可知，提取時間對花色苷的提取較明顯，整體呈現先上升后下降的趨勢，在30～60 min內，花色苷含量上升趨勢較明顯；而在60 min后開始緩慢下降，這可能是由于花色苷收到長時間熱效應的影響導致其分解[12]。所以，選擇提取時間為60 min。

圖4 提取時間對花色苷含量的影響Fig.4 Effect of extraction time on anthocyanins content

2.3 響應面優化結果與分析

2.3.1 模型的建立與分析

依據方法1.3.4進行Box-Behnken試驗，試驗設計與結果見表3。

利用Design Expert軟件對表3的花色苷含量進行方差以及回歸分析，得到響應值與各變量之間的回歸方程為：

表3 Box-Behnken試驗設計與結果Table 3 Results of response surface experiments

為了檢驗方程的有效性，對該數學模型進行方差分析[13]，回歸方程方差分析結果見表4。由表4可知，一次項中，A（料液比）、C（提取時間）對試驗結果影響顯著（P＜0.05），B（提取溫度）影響不顯著（P＞0.05）；二次項中A2、B2、C2的影響均顯著（P＜0.05）；經方差分析可知模型P=0.002 5＜0.05，達到顯著水平，失擬項P=0.069 6＞0.05未達到顯著水平，表明試驗設計合理，該模型能準確的描述各變量因素與響應值之間的關系[14-16]。

表4 回歸方程方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation

2.3.2 響應面的分析與優化

通過模型方程得出的響應曲面圖、等高線圖結果見圖5。由圖5可知，料液比、提取溫度兩因素間的交互作用明顯大于AC以及BC之間的交互作用。根據等高線的形狀可判斷交互作用的強弱[17]，橢圓形表示兩因素之間交互作用顯著，圓形表示則表示交互作用不顯著[18-21]。

圖5 料液比、提取溫度和提取時間的交互作用對花色苷含量影響的響應曲面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour line showing the effects of interactions of solid-liquid ratio,extraction temperature and extraction time on anthocyanins content

2.4 驗證試驗

響應面優化得到的最佳工藝條件為料液比1∶7（g∶mL）、提取溫度50.93 ℃、提取時間64.73 min，此條件下得到的花色苷含量58.32 mg/100 g。實際操作過程中選擇料液比1∶7（g∶mL）、提取溫度51 ℃、提取時間65 min。

為了確保響應面優化條件的準確性，采用上述優化條件進行了3次驗證試驗，試驗結果表明，該條件下得到的花色苷含量為56.45 mg/100 g，相對誤差為3.2%，說明通過響應曲面法得到的參數準確可靠，具有可行性。

3 結論

從新疆樹莓中提取花色苷工藝的單因素和響應曲面法分析，得到了該試驗的最佳提取工藝條件為料液比1∶7（g∶mL）、提取溫度51 ℃、提取時間65 min，該條件下得到的花色苷含量為56.45 mg/100 g。該研究為新疆樹莓中花色苷的安全有效生產提供理論和技術依據。

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